第四节　丙型肝炎病毒基因分型

HCV具有高度的变异性，不同HCV分离株的核苷酸及氨基酸同源性有较大的差异，因此对HCV进行分型有助于了解各地区HCV的流行及进化情况，为HCV的诊断、治疗、预防等提供理论基础。

一、丙型肝炎病毒基因分型技术

（一）核苷酸序列分析分型法

HCV基因分型主要以核苷酸序列为基础。HCV分型最准确的方法是比较HCV全基因的同源性，核苷酸的同源性小于80%则分属不同的基因型，但HCV全基因组的克隆实际上很难做到。目前最常用的方法是PCR分型法，扩增有代表性的HCV基因片段如NS5、C、5'-NCR、E1等，并进行遗传进化分析而分型。该方法可直接得到HCV的有关靶基因序列，是HCV基因分型最经典、最可靠的分型方法。已报道的HCV分型约一半是基于该方法的。但该技术要求较高，耗时多，因此实验条件稍差的单位难以开展，更难以在临床上推广应用。另外，扩增DNA序列测定通常无法鉴定不同基因型的混合感染。

（二）型特异性引物PCR分型法

根据不同HCV型在某一区段序列的差异，设计一系列型特异性引物，不同型可扩增出不同的片段，并以此进行分型。具体做法是先设计一对非型特异性引物，对HCV进行扩增，再用型特异性引物进行第二轮PCR。由于常选用C区进行PCR分型，故该方法又称为CPCR。如 Okamoto 等设计的一对 C 区引物，可扩增出 57nt、144nt、174nt、123nt 4 种不同的条带，并据此把HCV分成Ⅰ～Ⅳ型。显然型特异性引物PCR分型法较DNA序列分析分型更为简便、快速、价廉，而且还可检测出不同HCV型的混合感染，但对PCR引物的设计要求较高，要保证各型之间有较大的差异，且每份样品需同时进行多次检测才能最终确定型别。

（三）型特异性探针杂交分型法

通过将生物素或荧光素标记的型特异性寡核苷酸探针固相化在膜或芯片上，与RT-PCR扩增的病毒产物进行杂交后，经过扫描，在相应的型特异性探针位置上出现荧光点，根据点位置确定HCV的基因型和基因亚型。用于该分型方法的探针常来自5'-NCR和C区。

（四）限制性片段长度多态性分型法

限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）根据不同型别的HCV在某一个相同的区段由于个别碱基的变异直接导致了某些酶切位点的改变，PCR扩增靶基因得到的产物经多种不同限制性内切酶酶切，不同型或亚型得到不同长度大小的片段，然后根据酶切后电泳所表现的片段大小及多态性进行HCV基因分型。5'-NCR、NS5保守性较高，常成为RFLP分型的首选靶基因。该方法常用酶为HaeⅢ、RsaⅠ、MvaⅠ、HinfⅠ、ScrfⅠ，利用这些酶可将6个基因型分开。RFLP分型法具有准确、快速、灵敏、经济等优点，适于对HCV感染者作大规模的筛查。但若只用少数内切酶则所能检测到的型别有限，且无法发现新的基因型。

（五）遗传树分型法

1993年Simmonds等提出亲缘关系分析法或遗传树（phylogenetic tree）分析法，得到大多数人的赞同。他们通过扩增来自欧洲、南美洲、北美洲、远东地区等的一系列丙型肝炎患者血清HCV NS5B的一个222nt片段（第7975～8196nt），进行亲缘关系聚类分析，发现不同型基因同源性在56%～72%，亚型为78%～88%，不同株间为88%～100%。按照分离株发现的先后顺序，每一型还可分2～3个亚型，分别用a、b、c表示。作者将HCV分成6型和11亚型，而且该方法还可与其他分型方法相对应。另外，以C、NS4、E1等作为靶序列，也可将HCV确定为6型。该方法不仅协调了各种分型方法，还可进行新基因型及亚型的命名。此分析方法可把5'-NTR区、C区、NS5B区、E1区作为靶序列分型，对一定区域内的样本测序结束后可将序列相互比较，分析样本间序列的进化距离，画出该区域内HCV流行的系统关系进化树，观察HCV在区域内的分子流行情况及特点，也可将样本序列与世界各地已发表的该区段序列比较，分析样本序列与其他序列的差异。

（六）DNA-酶免疫测定

DNA-酶免疫测定（DNA enzyme immunoassay，DEIA）是 PCR 结合酶免疫测定的一种新技术，其主要技术路线是设计C区引物，经RT-PCR扩增一段250nt的cDNA片段，再与生物素-亲和素上的特异性探针杂交，加入鼠抗dsDNA McAb及免抗鼠酶标二抗，反应结束后，测定并判断结果。90%以上的HCV分离株可通过DEIA分型，一般无假阳性结果。DEIA无同位素污染问题，操作简单、省时，适于HCV的分型。

上述方法均能正确鉴定主要基因型，但亚型的区分有赖于直接测序法。所有基于PCR的方法都具有PCR的优点和缺点。HCV基因分型方法的选择，应基于实验室的条件和经验以及分型的目的。若要鉴定所有亚型和新的型别，PCR结合测序是首选的方法。如果是以指导治疗为目的，仅需将1型感染和其他型别感染区别开来，上述的任何一种方法均适用。

二、丙型肝炎病毒基因分型系统

由于不同的学者曾采用不同的分型靶基因以及不同的基因型命名方法，建立了各自的HCV基因分型系统，因此基因型命名一度甚为混乱，无法对比各实验室的研究结果，也缺乏统一的鉴定标准。这一状况在1995年以前特别严重。Simmonds等根据病毒基因组核苷酸序列的同源性提出了一套HCV基因型分类命名系统，与以往的命名系统有大致的对应关系（表1-3-1）。1994年在第2届国际HCV及其相关病毒学术会议上，一致推荐Simmonds HCV基因型分类命名系统，现已广为接受，HCV基因分型与命名的混乱局面已得以改观。该系统按照核酸序列的同源性分型，核酸特异性小于75%则分属于不同的基因型，同型内非常相似的变异株称为亚型，不同基因型之间核酸同源性介于75%～90%，同一亚型内的不同分离株间的同源性大于90%。依据发现顺序，用阿拉伯数字命名HCV基因型，用小写英文字母命名亚型。

三、丙型肝炎病毒基因型的地理分布特点

HCV基因型分布存在明显的地理差异，6种主要基因型分布广泛，其中1a和1b型是美国最常见的基因型，也是欧洲的优势型别。在日本，1b型占HCV感染中的73%。2a和2b型在北美、欧洲和日本相当常见，2c型常见于意大利北部。3a型在美国和欧洲的静脉药瘾者特别常见。4a型在北美和中东占优势。5a型局限于南非，6a型主要见于我国香港地区、麦加和越南，7、8、9型仅见于越南患者。10、11型见于印度尼西亚患者。关于HCV分离株应当归入的基因型数目存在不一致的意见，有学者认为7～11型是相同组别的变异株，应将其归入单个基因型，即6型。多数资料表明，中国内地（大陆）仅有1b和2a两型，且以1b型为主，南方城市（南京、南宁、成都），1b型占90%以上，北方城市（哈尔滨、沈阳、兰州），2a型占46%～70%，基因型多样性不如我国香港和台湾地区，也低于日本，但混合感染率明显高于其他国家和地区。国内报道采用Enomoto分型法在10余省、市的122例血清标本中发现5个基因型（RT、K1、K2a、K2b、K3），其中 K1和 K2型占 75.4%。这一结果可能与样本来源、检测方法等因素有关，有待进一步研究证实。目前我国在HCV基因分型中所用方法难以检出6a或其他新基因型，因此不能除外有其他基因型感染的可能。此外，多数研究以慢性肝病患者为调查对象，影响结果的可比性，不像无症状HCV阳性献血者更能反映HCV基因型在人群中的分布。

四、丙型肝炎病毒基因型的临床意义

（一）流行病学标志

HCV基因分布存在着地理差异，因此当HCV在人群中暴发时，基因分型可作为追查其根源的有效工具。HCV主要传播途径是直接与患者血液接触，通过对不同人群HCV分子学研究，使包括垂直传播与性传播在内的HCV其他传播途径受到广泛关注，并证实HCV可在结肠镜检查时于患者-患者间传播。Zein等人发现HCV基因分型与所选择的研究对象没有关联，但不少研究者证实了这种关联，他们指出，3a型和1a型在静脉药瘾者中多见，1b型多见于HCV血制品传播中。从而证明基因分型对追踪HCV流行来源有重要意义。

（二）感染的诊断

通过对献血员检测血清中抗-HCV抗体进行筛选，是目前阻止HCV传播的主要方法，但这种筛选的成败关键依赖于不同分离株间序列变异的程度。第一代HCV检测抗原由HCV基因1型NS4区编码的5-1-1、C_100-3组成，不与其交叉反应的基因型可被漏检。第二代HCV检测抗原，增加了比较保守的C区抗原。第三代试验在二代的基础上增加了NS5区的抗原，从而，大大提高敏感性和特异性，降低基因分型的影响。HCV RNA逆转录PCR扩增已经渐渐成为HCV感染诊断和患者个体化治疗所必需的试验，其主要优点包括对急性感染和病毒血症的早期诊断，但其敏感性受到引物选择及标本处理的影响。

（三）急性HCV感染的转归

感染了HCV后，绝大多数（80%）患者不能自行清除，而发展为慢性肝炎。Amoroso等人研究了基因分型在急性感染转变成慢性HCV中的作用，发现92%1b型急性感染患者会进展为慢性化，而其他类型仅35%～50%。而这一现象已成为研究的焦点。有人认为，细胞免疫和体液免疫是自行清除的关键，但尚未被论证。也有人认为，可能是病毒基因高度变异发生免疫逃避或者是病毒滴度低引发机体CTL反应太弱。

（四）对干扰素治疗的应答

多项临床研究表明，对干扰素α抗病毒治疗应答性有影响的常见因素包括年龄、病程、肝硬化、基因型和HCV RNA血清水平。多元分析表明，1b型、高水平的HCV RNA是唯一对干扰素α治疗无应答的独立性预测因子。普通干扰素α治疗24周，2型的患者对干扰素的完全应答占60%～70%，而1型患者仅占10%～15%。Peignoux等对法国141例慢性丙型肝炎经干扰素α治疗的研究中表明，1b型的持续有效率最低仅为4%，非1b型达32%；特别是3a型的持续有效率高达38%。长效干扰素（即聚乙二醇干扰素，pegasys）对丙型肝炎患者的疗效明显优于普通干扰素α，但在各基因型中也存在差异。Perry等报道，HCV基因型1型对聚乙二醇干扰素治疗的持久病毒学应答率为28%，而基因型2/3型患者中持久病毒学应答率为56%。

有关HCV体外感染的细胞模型及体内动物模型详见第一篇第七章第二节相关内容。

（林旭）