动植物区系调查仅提供了鼠疫疫源地存在的可能性，只有实际发现鼠疫的流行，即在一个地区的动物或媒介中分离获得鼠疫菌，鼠疫的自然疫源地才能得以确认。在这一调查过程中，在动物中检测针对鼠疫的抗体，可以为发现疫源地提供线索。

与大多数人兽共患传染病相同，鼠疫只是个体生命中相对短暂的过程。只有在疾病急性发作的期间内，才可能检出病原微生物，或在略长的时间段内检出微生物的核酸与抗原。相反，当动物感染了疾病之后便能产生抗体，而抗体常常可以保持数月、数年甚至一些动物的终生。通过检测抗体能有更多的机会发现疾病。因而，抗体检测是鼠疫疫源地调查中的一个重要步骤。实践表明，在检出抗体的地方，只要能够坚持进行调查，绝大多数情况都能在数月甚至数年后，通过病原检验最终确定疫源地的存在。

有两种方式可以发现疫源地存在的线索，对指示动物的调查和啮齿动物中的血清学调查。

在许多疾病的调查中，当宿主尚未明确或疾病可能分布在较大范围时，可以采取调查指示动物的方式。

作为指示动物，必须具备以下条件：①易于取得标本；②与疾病的宿主动物存在较为密切的关系；③能够反映病原微生物的存在情况；④有较大的活动范围。

鼠疫疫源地调查中常利用狗作为指示动物。狗是人类饲养的动物，获得狗的血液标本并不困难；狗虽然不专以啮齿类为食，但经常追捕它们。当啮齿动物患病时，更容易被狗捕获。因而，狗经常从啮齿类受到感染。鼠疫对狗是一种相对温和的疾病，狗患鼠疫后常能自愈并产生抗体，检测这类抗体就可以提供疾病流行的线索。狗有较大的活动范围，一只狗常可反映方圆十数公里内的鼠疫活动。因此，检测狗血清中的抗体，是鼠疫疫源地调查的重要手段。同理，狐、獾食肉动物经常以鼠类为食，也可以认为是指示动物，只不过野生食肉动物难于捕获，来源较狗困难。在疫源地调查过程中捕获的这类动物，也应注意进行抗体检测。

在鼠疫调查中，还经常利用鹰作为指示动物。鹰的血液标本不容易获得，因此并不使用抗体检测的方法来进行监测。啮齿动物是鹰的主要食物，患病的动物更容易捕获；由于鸟类的高体温，鹰接触鼠疫后并不容易发生感染，它们将捕获物衔回它们的巢穴，从而起了富集患病动物的作用。食剩的毛皮和骨骼，便弃于鹰巢之下，鹰还会把生吞下去的动物尸骸，消化肌肉之后剩余的部分再吐出来。因而，找到一处鹰巢，常可以从其遗留物毛皮的内面，骨髓之中分离获得鼠疫菌。在旷野、荒漠等地区，只要看到鹰在空中盘旋，常意味着下面存在着死亡动物的尸骸。在鼠疫监测中，也常根据这一线索，发现死于鼠疫动物的尸体。鹰可飞翔很长的距离，一窝鹰有时可以提供上百公里范围内鼠疫的线索。

应当注意，对指示动物的监测，只是搜索疾病存在的线索，不能作为疫源地存在的依据。一只抗体阳性的狗，其感染地点可能就在其生活地点，也可能在其活动距离为半径区域内的任何地点。而鹰的活动半径更大，很难确定鼠疫的自然疫源地究竟存在于它们活动范围内的什么地方。然而，只要在指示动物中有所发现，就能够有把握地在它们的活动范围内确定鼠疫的自然疫源地，这也使调查限制在一定的范围之内，使调查的消耗大为节省。

到目前为止，所有已经发现的鼠疫自然疫源地都以啮齿动物为主要储存宿主。因而，从啮齿动物中检测鼠疫的抗体，有更多的机会提供鼠疫自然疫源地存在的线索。在疫源地调查中捕获的啮齿动物，都应当采取血液标本，从血清中测定抗体。使用鼠夹等工具捕获的啮齿动物尸体，也可以采取含血量丰富的组织，从浸出液中测定抗体。

不同种类的啮齿动物产生抗体的机会不同。一般来说，能够感染鼠疫，但相对具有抗性的种类，检出抗体的机会较多。而对鼠疫高度敏感的种类，寿命较短的种类，发现抗体的机会不多。因此，应尽可能测定在疫源地调查中捕获的所有种类啮齿动物中的抗体。抗体阳性的种类，虽并不一定是鼠疫的储存宿主，却在更高程度上提示了鼠疫自然疫源地的存在。

在疫源地调查中，正确地解释血清学调查的结果非常重要。鼠疫是一种病原微生物存在于细胞之外的急性疾病，抗体通常在疾病进入恢复期后才出现。因此，调查中发现抗体，只是疾病流行的一种间接线索。对大多数鼠疫宿主出现抗体的个体已经不再具有传染性，也不再是流行的组成部分，但它提示在附近的地区，可能还有其他个体处于疾病过程之中，构成疾病在动物间的流行。这就需要判读抗体水平和免疫个体在种群中所占的比例。抗体的滴度很低，抗体的阳性率也很低时，说明抗体只是过去很久的流行的痕迹。出现这种现象，说明调查的地区符合作为疫源地的条件，需要继续监视以发现未来的流行。抗体滴度很高，阳性个体占据种群的一定比例，说明流行还在继续，这时只要在发现抗体阳性的周围地区坚持调查，就一定能够发现正在疾病过程中的个体，疫源地便可确定。而如果种群中绝大多数的个体中都存在相当高的抗体，说明流行已经终结，在一段时间之内疫源地不会重新活动。

啮齿动物中的鼠疫抗体虽然仍是发现鼠疫自然疫源地的线索，但与指示动物相比，却为确定得多的线索。这是因为，在我国已经查明的鼠疫自然疫源地中，大多数鼠疫宿主在正常条件下活动的范围都不大，多为数百米。因而，一旦在啮齿动物中发现高滴度的鼠疫抗体，可以确定鼠疫自然疫源地就存在于半径1km的范围之内。

当前，在所调查的地区中分离获得鼠疫的病原微生物是确定该地区存在鼠疫自然疫源地的唯一标准。这是因为，鼠疫菌是一种从肠杆菌进化而来的微生物，从其进化祖先获得的各种性状，多数缺乏特异性。而鼠疫菌特异的抗原或其他成分，多由外来的基因编码，不能保证自然界中不存在其他的来源。因此，无论抗原、抗体还是基因检测，都存在着非特异的危险，而且都是一次性检测，难以事后复核。唯有分离获得鼠疫菌，才是疫源地存在没有歧义的证据，而且是可以永久保存的实物证据，可以在任何时候加以复核，并进行更深入的研究。

在我国已经查明的大多数鼠疫自然疫源地中，主要储存宿主和经常感染的其他宿主都对鼠疫菌具有相当的敏感性，感染后迅速发病死亡，极少出现活的啮齿动物长期携带鼠疫菌的现象。在我国以往进行的自然疫源地调查和鼠疫监测中，绝大多数的鼠疫菌都由自行死亡的鼠类尸体中分离，从活的啮齿动物中分离鼠疫菌的机会不到3%。因此，在疫源地调查中，为了分离鼠疫菌，需要专门发动群众搜索自行死亡的啮齿动物和其他动物的尸体，这是一种非常艰苦的搜索。啮齿动物死亡后，其尸体很快就会被食腐动物清除，因此常需要在黎明时分进行搜索。鼠类的尸体极为分散，常遗留在鼠洞的洞口之内或其他隐蔽的地方，需要仔细地寻找。因而，必须反复地发动群众，在各种可能的生产与生活活动中留意发现患病或死亡的鼠类。调查队员也应该将搜索鼠尸作为重要任务，根据对鼠类生活习性的了解，重点搜索那些鼠类最可能死亡的地点，如隐蔽处和饮水处。

当然，在流行刚刚开始，鼠类还没有死亡或流行趋于结束，多数个体产生抗性的时候，也有机会从捕捉到的啮齿动物中分离获得鼠疫菌。此外，我国最近在新疆准噶尔盆地的大沙鼠中确定了鼠疫自然疫源地的存在。大沙鼠是一种对鼠疫高抗性的种类，在大沙鼠鼠疫地区，很容易从活的啮齿动物中分离鼠疫菌。因此，在疫源地调查中，也应该从捕获的啮齿动物和其他动物中，抽取一定的比例，进行细菌分离的工作。

解剖所获得的鼠类尸体或捕获的动物，以无菌操作取被检动物的淋巴结、肝、脾、肺、心和骨髓六部位标本直接压印在培养基上，用接种环画线，注意各标本接种区域间画线不能交叉。每份标本画两个平皿，28℃培养，其中之一留作噬菌体裂解试验。如果被检标本已经腐败，则必须取股骨骨髓，用灭菌生理盐水研磨制成悬液接种。逐日观察培养物，挑取形态类似鼠疫菌的菌落进行进一步鉴定。

从节肢动物，特别是从病/死鼠体表检获的蚤类中分离鼠疫菌。蚤类或其他节肢动物可单匹培养，也可同一寄主同一种类成组培养。在现场工作中，蚤类检菌的阳性率比捕获鼠类高出若干倍，有时占到检出鼠疫菌的70%左右，对这类标本的检测要特别的注意。

一旦在疫源地调查中分离获得了鼠疫菌，疫源地及其存在的位置便已确立。接着，需要从第一次发现阳性的地点开始，向各个方向扩展调查，以确定疫源地分布的范围。

疫源地的范围有两种不同的概念。一种概念是疫源地可能存在的范围，这需要继续进行上面所述的动物区系调查、节肢动物区系调查以及生态环境调查，直到发现明显的改变。这种概念的疫源地范围常具有明显的边界，如高山、大河、荒漠等宿主动物难以通过的地区，或者因为植被或其他自然条件的改变而不适合于宿主生存的地区，都可以成为疫源地的边界。一片在地理上相互连续，而在其周围被上述边界环绕的地区，就可以认为是这种疾病的疫源地分布的范围。这样的地区需要置于监视之下，不管其中的部分是否发现过疾病的流行。

另一种是动物间疾病现实流行的范围。在扩大的调查中，将会发现其他的患病动物，直到再不能检出患病的动物为止。每一次发现，都认为是一个疫点。以这个疫点为中心，该种动物通常活动的距离为半径，如啮齿动物通常定为1km，这样划出的圆形范围就是这次感染可能蔓延的范围。将所有这样的圆形区域按照切线方向连接起来，便是正在活动的疫源地范围。这一范围，是对人类最具威胁的疫源地范围。但需要注意，在该次调查中没有发现疾病活动，但具有同类生态条件的区域，并不意味着将来不会受到波及。因而，当需要进行疫源地处理时，应当主要以第二种概念来界定疫源地的范围。而当需要设置监测时，则需要以第一种概念为主。

鼠疫自然疫源地的存在确定之后，就需要确定什么是该疫源地的主要储存宿主。这一工作，需要通过调查和试验两条途径进行。

在不同的鼠疫疫源地内，主要储存宿主的表现可能是不同的。因此，每一次发现新的疫源地时，都需要重新确定主要储存宿主。现场调查能够为确定主要储存宿主提供重要的线索，但在大多数情况下，还需要通过实验室研究来获得确定性的证据。确定主要储存宿主应主要通过以下试验：

对于那些受到感染之后显性发病甚至死亡的动物，感受性试验是确定其主要储存宿主地位的首选方法，主要的方式是测定感染后的半数致死量。

为什么要采用半数致死量，而不是导致全数致死的感染剂量呢？这是因为不管导致全数致死或者全数存活的剂量，都严重地受到个别动物的影响，因而极不准确并缺乏可重复性，而半数致死量代表着多数动物的结果，比较具有代表性。

既然是以确定主要储存宿主为目的的半数致死量测定，试验的对象必然是从疫源地调查中捕获的野生动物，选择合适的试验动物便是试验可靠性的先决条件。首先，试验动物必须事先通过健康观察，其次，体重、性别也是必须要考虑的条件。在决定主要储存宿主时，疫源地内有无动物间的疾病流行，对结果会有很大影响。有必要分别从存在疾病的地区和从来没有发现疾病踪迹的地区分别捕获试验动物，并比较其感受性。具有明显区别的动物，更可能作为主要储存宿主。采用的感染方法应尽可能接近该病在自然条件下的感染方式。可采用的方法有：皮下注射、皮内注射、腹腔内注射、静脉注射、脑内注射和鼻内接种等。

测定半数致死量可采用两种方法。通常采用的标准半数致死量测定方法已为人们所熟悉。将动物按照尽可能均衡的条件分成5个以上的组，分别接种不同剂量的病原微生物，选用的最大剂量最好能使动物全数死亡；而最小剂量组的动物又能全数存活。观察一个最长的发病周期后，按照统计学的标准方法来计算半数致死量。然而，捕获的动物数量较少，难于分组时，可以采用一种称为“上下法”的方法：一只动物接种后如果不发病，那么下一只试验动物提高一个剂量等级；相反，如果动物发病死亡，那么下一只动物则降低一个剂量等级。依次进行10~12次试验后，便可计算出半数致死量。计算的公式，可以查阅统计学专著。这两种方法可以根据情况选用，第一种方法对试验动物的数量和条件要求较高；第二种方法中每一只动物的试验都需要依据上一只动物的试验结果，因而需要较长的时间，也更难保持试验条件的一致。

野生动物的半数致死量测定受许多因素的影响，通常不可能得到非常有规律的结果。按照统计学所提供的公式，每一次试验都可以计算出半数致死量。然而，在统计学中这种计算出来的数值并不一定都有意义。故每一次半数致死量测定都必须进行显著性测验，统计学上提供了进行显著性测验的方法。具有统计学显著意义的半数致死量才能代表动物对疾病的感受性程度，但如果半数致死量统计学不显著，并不意味着这种动物不是主要储存宿主。相反，感染量与死亡不成比例，小的感染剂量也能导致动物死亡，而最大的感染剂量下仍有动物存活，正是鼠疫主要储存宿主应有的表现。

鼠疫菌在动物体内造成菌血症的能力，常是通过吸血节肢动物传播的条件。半数致死量测定计数的，通常只是动物的死亡或存活，要了解病原微生物在动物体内存在与排出的情况，需要另外一种类型的试验。

病原微生物能够主动排出的疾病，需要进行动物的排出物或分泌物中微生物的数量测定。在大多数情况下，动物的粪便、尿、口鼻腔分泌物还有从动物腔道中流出的血液，是最常检验的目标。这种测定在技术上较为困难，因为这些排出物和腔道通常都不是无菌的，环境中的微生物会对试验结果产生严重的干扰。因而，在上述材料中检出致病微生物，通常需要采用强选择性的分离方法，而且只做定性测定。啮齿动物在感染鼠疫后，鼠疫菌通常都不会由腔道排出体外，因此一般不进行这样的测定。

像鼠疫这样通过吸血节肢动物传播的疾病，通常需要测定动物的菌血症强度和内脏中的病原含量，需要了解病原微生物在动物机体中的繁殖动态。这就需要一次感染一批动物，然后按照一定的时间间隔处死动物，计数其血液和内脏中的病原微生物数量。由于这些材料在正常时是无菌的，因而能够使用细菌的菌落计数方法，精确地测定出标本中病原微生物的数量。需要注意的是，在野生动物中，疾病过程中微生物的数量可能变化很大，因此难以估计正确的稀释度，无法精确计数。解决的办法是，对每一份标本进行系列稀释，同时对不同稀释度的标本进行测定以及将标本保存在可维持病原微生物生存而不繁殖的条件下，待得到计数结果后再废弃。

病原携带和排出能力试验可以为疾病在动物间的流行提供许多宝贵信息，它能够提供疾病的保存条件、传播条件，也能够提供病原微生物的繁殖和清除与抗体等免疫机制的产生在时间上的关系。

在疫源地调查中，可以获得关于啮齿动物及其鼠疫的大量资料，这就需要对这些资料进行综合分析以确定哪一种动物符合主要储存宿主的条件。过去，在“一元论”的思想指导下，特别强调找到符合所有条件的一种动物。如今已不是那样强调单一的储存宿主，但作为主要储存宿主的几种动物，也必须能够互补而维持疾病的长期存在。

首先应当考虑分离鼠疫菌最多的种类。容易分离鼠疫菌，至少说明鼠疫在这种啮齿动物中广泛流行。在随后的监测中，应当注意观察在每一个流行季节中鼠疫菌是否总在这种动物中最先出现。当这种动物中的鼠疫停止流行时，其他种类动物中的流行是否很快随之停止。对于经常能够分离鼠疫菌的种类，还应观察其在疫源地中的数量和分布。作为鼠疫的主要储存宿主，应当是在疫源地中数量较多，分布广泛，其数量经常可以由更广阔的低数量地区补充的种类。在我国的许多鼠疫自然疫源地中，大足鼠常是鼠疫菌分离率最高的种类，但这种啮齿动物的数量很少，分离的鼠疫菌总数也就不多，这样的种类，不会是鼠疫的主要储存宿主。

可能为主要储存宿主的种类，还应在实验室中进一步核实。大多数情况下，主要储存宿主对鼠疫菌的感受性应当为中等，动物可能在低接种剂量下死亡，也可能在高接种剂量下存活。在部分类型的疫源地中，高敏感性的啮齿动物也可能成为主要储存宿主，但必须具有高繁殖能力使种群迅速恢复。低感受性的种类也有可能成为主要储存宿主，但必须具有长期带菌并出现再次急性化的能力。

主要储存宿主还应当在感染鼠疫后能够产生持续较长时间的、高水平的菌血症，以致跳蚤叮咬时，由毛细血管中就可以获得足够数量的鼠疫菌，造成蚤感染并形成传播。虽然可以在一些种类中大量地分离到鼠疫菌，说明其种群中感染普遍，但其血液内的含菌量不高，这样的种类在鼠疫流行中的作用，可能比不上那些分离率略次，但经常能在血液中分离鼠疫菌的种类。

鼠疫的主要储存宿主确定之后，需要确定疫源地中的主要传播媒介。在早期的鼠疫疫源地调查中，确定主要传播媒介的根据比较简单，寄生于主要储存宿主的优势蚤种，就是该疫源地的主要传播媒介。

然而，在一种啮齿动物的体表或它们的巢穴中，常寄生着多种蚤类，它们均具有很高的数量，从这些种类的蚤中都可以分离到鼠疫菌。因此，确定主要媒介也需要实验室研究的配合。

用于确定宿主的实验研究主要依靠捕获的野生动物不同。节肢动物体形小，捕获后难以保持存活，也难于捕获实验所要求的足够数量。因此，用于确定主要媒介的实验，主要依靠人工繁育来获得实验的对象。节肢动物生命周期短，繁殖迅速，人工繁殖也利于获得大量的、条件一致的个体，使实验更为精确。

昆虫纲的节肢动物发育为多态性，有的是渐变态，有的是半变态，有的是全变态。完全变态昆虫，其生活史主要分为卵、幼虫、蛹、成虫4个阶段。幼虫与成虫在形态上和生活习性上完全不同。昆虫类在生长发育过程中，若遇到恶劣气候、食物短缺等，会停止代谢，进入休眠期。

蜘蛛纲的节肢动物多为不全变态，幼虫就具有类似于成虫的形态，也有类似的生活习性。一个生活阶段称为一个龄期，通过蜕皮进入下一龄期，实现形态的改变和体形的增大。在蜕皮之前吸血，常是完成变态的先决条件，也是传播疾病的必要条件。

为了人工繁育节肢动物来进行实验，必须了解这些生物的生活史。鼠疫传播媒介的确定，主要是对蚤类的研究，必须通过对蚤类生活史的了解，掌握繁育的方法和技巧。

可以从现场捕获成虫，也可以收集已经产下的卵块，作为繁育的起点。一般而言，节肢动物的交配少有限制，产卵数量很多，繁育一般没有问题。一个品系一旦在实验室中繁育成功，就可以通过留种的方式继续繁衍下去。

蚤由卵孵化成为幼虫，以及由蛹羽化成虫的过程，通常要求严格的温度和湿度条件，因而繁育工作需要在恒温、恒湿的环境中进行，每一种蚤需要的条件各异。孵化出幼虫后，需要供给幼虫适当的食物，以保证幼虫的发育。昆虫在蛹的阶段无需食物，对外界环境的要求也不严格。一旦羽化成虫，或达到吸血的龄期，蚤就可以用于实验。节肢动物的寿命短暂，实验应当及时开始。因此，应当事先计算节肢动物每一个生命阶段所需要的时间，提前做好实验准备，以便实验能够在节肢动物正确的发育阶段开始。

吸血节肢动物作为疾病的传播媒介，其吸血的过程就是感染的过程。因而，为造成节肢动物感染，首先要解决饲血的问题。

在试验中，饲血通常采取两种不同的方式。对于较大的节肢动物种类，如蜱，可以采取限制节肢动物活动的方式。将蜱置于小盒或纱网之中，以胶布或其他方法将盒或纱罩固定在动物的皮肤表面，蜱就会叮上去吸血。用这种方式，不仅可以用于饲喂、感染，还可以用于测定节肢动物的吸血嗜性。

蚤类这样较小的昆虫，可以采用固定被吸血动物的方法。可以将小型鼠类等动物装在小铁丝笼里，不让其跑动，然后丢进饲养蚤的容器中去。这样，大量的蚤就可以叮上去吸血。饲血完毕之后，回收附着在动物体表的或已经吸过血的蚤，可以在显微镜下计数已经吸血的数量和比例。如果动物已经受到感染，还可以通过病原微生物的分离培养，确定已经被感染的数量和比例。为了使研究更加精确，还可以使用人工饲血装置，实际测定多大的剂量可以造成感染。

感染试验仅能确定蚤类是否受到感染，而确定疾病是否能够在动物个体之间实际发生传播，需要依靠传播试验，即令蚤类叮咬患病的动物再叮咬健康动物，最后观察受到叮咬的健康动物是否发病。

传播试验的原理尽管简单，但实际操作却受到许多因素的影响，需要丰富的经验和高超的技巧，才可能有较多的机会获得实验的成功。

首先是菌血症形成的时机。以一定量的微生物感染动物，经过一定的时间可以形成菌血症。然而，由于动物的个体差异，菌血症形成的时间却可能有数日的变动。这就给掌握饲血时机造成了困难。太早，无法使蚤类感染。过晚，动物就会死亡，试验也就无法进行下去了。在鼠疫的传播试验中，可以观察发现竖毛、行走蹒跚等迹象时再行饲血，并对饲血后的动物采取标本进行分离培养，以确定细菌是否已经在血液中出现。

其次是病原微生物在媒介体内的增殖时间。病原微生物感染媒介生物之后，需要经过一定的繁殖时间，微生物才能在其口器处出现，而这一时间，也会有一、二天的差异。掌握不好，将成为试验失败的主要原因。可以观察吸血后的蚤，检查是否已有菌栓形成；最后将已经感染鼠疫菌，并形成菌栓的跳蚤分组叮咬试验动物。

最后，叮咬健康动物时所用的媒介数量和时间。所有这些，都需要事先进行预备试验，初步确定变化的范围。在正式试验时，需要增加在时间上略有差异的重复试验，也可以增加对中间环节的观察，以增加试验成功的机会。对试验后死亡的动物进行细菌学培养或至第7天将所有动物处死，进行血清学和细菌学试验，以确定是否已经受到鼠疫感染。

将现场调查和实验室调查的结果进行综合评定，才能够可靠地判断作为主要媒介的节肢动物种类。这种综合评定十分重要，有时可以揭示掩盖在表面假象下的内在规律。

例如，在20世纪70年代，在我国的云南发现了一种存在于野生啮齿动物之中的新类型的鼠疫自然疫源地。经过调查，确定了齐氏姬鼠和大绒鼠为主要储存宿主，而在这两种啮齿动物的体表，数量最多的是一种叫做方叶栉眼蚤的蚤类，而在这种蚤的体内，分离获得的鼠疫菌也最多。调查的结果，支持这种跳蚤作为这一类型鼠疫自然疫源地主要媒介的地位。

然而，直到进行了传播试验，才发现方叶栉眼蚤虽然可以感染鼠疫菌，但它将细菌传播到健康动物的能力却很差。相反，数量列第二位的特新蚤指名亚种，却能够顺利通过传播试验，具有强大的在动物间传播鼠疫的能力。再回过头来分析当初的调查资料，才发现特新蚤指名亚种除了数量较少之外，其他条件都符合作为主要媒介的条件。

确定主要媒介的正确种类具有重要的实际意义。因为疫源地疾病的流行依靠主要媒介维持，在很多情况下也需要通过主要媒介将疾病传播到人类。因而对疫源地调查，主要媒介的数量进行监测，可以成为决定疫源地是否会传人活动、是否会对人类构成威胁的早期预警指标。由于不同的节肢动物出现在不同的空间和不同的季节，在疫源地处理中，主要媒介的存在与否，就成为在何时、何处采取控制措施的重要指导因素。至于形成主要媒介的原因以及由于外界条件的变化造成主要媒介种类的变迁，则是人兽共患传染病控制中需要深入研究的课题。

在一个新的地理区域确定了鼠疫自然疫源地存在之后，需要确定疫源地的性质，即确定该疫源地究竟属于毗邻的鼠疫疫源地的组成部分，为某种已知的鼠疫疫源地中的相对独立的类型，还是一种新的鼠疫自然疫源地类型。自然疫源地的性质，需要根据鼠疫菌的遗传特征、主要储存宿主和疫源地所属的自然地理环境综合判断。

前面已经介绍过，鼠疫菌种的不同类型是隔离形成的。鼠疫自然疫源地的不同性质，也是隔离形成的。疫源地中流行的鼠疫菌遗传特征的差异，反映了自然疫源地相互隔离，也就成了判断疫源地性质的首要指标。

目前仍然认为，全世界的鼠疫菌都源自同一祖先，分布在世界各地的疫源地，都是由于起源悠远、自古至今持续不断的流行过程形成的。在漫长的史前年代中，这种流行可以将鼠疫带到遥远的地域，也可借助飞禽或其他一些原因，跨越高山海洋，甚至由于人类的活动，被携带到世界的不同角落。当鼠疫流行到或者被携带到一个新的地区时，可能由于自然条件不适合鼠疫自然疫源地的存在条件而迅速消失，也可能偶然遇到了新的适合鼠疫流行的宿主，因而在新的条件下保持下来。当造成转移的事件一旦过去，或者由于自然条件的改变，使新疫源地与它们的起源之间被不适合疫源地存在的区域隔开，一片不同的疫源地就被遗留在世界的不同的角落，与它的来源失去了联系。

微生物是在不断突变的，随时可以出现新的特征。如果这种新的特征支持微生物更快地繁殖，或者像鼠疫菌这样的病原微生物能够引起更严重的疾病，使它在动物个体间更快地传播，这种具有新特征的微生物就会保存下来，甚至取代其祖先成为优势流行的微生物。这就是选择，选择过程造成微生物的变异。我们可以设想，如果突变和选择的过程发生在一片疾病可以无阻碍地传播的疫源地中，那么新发生的特征或者会取代原有的特征，或者与原有特征混合起来，甚至在一头患病的啮齿动物中，也可以发现特征不同的菌细胞。

当一片疫源地与其来源或者其他的疫源地相互隔绝，疾病不能相互传播的时候，突变和选择的过程就会向不同的方向发展。经历一定的时间之后，不同的疫源地中流行的细菌就会显示出明显的、可以相互区分的特征，也就形成了鼠疫菌不同的“型别”。

这意味着，如果两片疫源地中的鼠疫菌属于不同的型别，这两片疫源地中的鼠疫流行就不是相互传播的，疫源地也就具备了相对独立的性质。生活在一片疫源地中的人，一般不会受到另一片疫源地中鼠疫流行的威胁。如果这两片疫源地进而具有不同的主要储存宿主，疫源地之间的差异就上升到不同的类型，其鼠疫流行时就会有不同的规律性，疫源地间就应当采取不同的控制措施。而如果鼠疫菌间的差异涉及毒力机制，不同的疫源地便对人类构成不同程度的威胁，所有的鼠疫防制策略都需要分别考虑。

因此，当鼠疫的疫源地调查中已经积累了一定数量的鼠疫菌株，就应当进行细菌遗传特征的鉴定，从而确定疫源地所属的类型以及与周围已经发现的疫源地之间的关系。

研究者很久以前就开始了通过鼠疫菌间的差异来分析鼠疫来源的尝试。人们最初发现，鼠疫菌能否酵解利用甘油，是一个具有明显区别的特征。第三次世界鼠疫大流行波及的港口及沿海地区，分离到的鼠疫菌都不能利用甘油，这样的鼠疫菌被称为“海洋型”。相反，远离海岸地区分离的鼠疫菌都能够利用甘油，这样的鼠疫菌被称为“大陆型”，且被认为属于原始的、未流行前的鼠疫自然疫源地。在海洋型鼠疫菌的分布地区，鼠疫易于流行但病势相对较轻。而在大陆型鼠疫菌的流行地区，人类的感染不常发生，但病势极为沉重，极易转为肺鼠疫或死亡。

后来又发现鼠疫菌产生亚硝酸盐的能力也可以作为分型的指征，亚硝酸盐可以是由硝酸盐还原，也可以是由氨硝化产生。这一指征的引入将大陆型又划分为两个部分，从而形成了三个“变种”，并与历史上曾经发生的三次世界鼠疫大流行联系起来。“古老变种”甘油阳性、亚硝酸盐阳性，可能为第一次世界大流行，即“汝斯汀鼠疫”的起因。“中世纪变种”甘油阳性、亚硝酸盐阴性，为“黑死病”的起因；而“东方变种”甘油阴性、亚硝酸盐阳性，可以确定始于香港的第三次世界鼠疫大流行是由这种鼠疫菌引起的。

在这之后，世界上许多国家都进行了更加细致的分型研究，建立起更完善的分型系统。在我国，主要根据甘油、亚硝酸盐、鼠李糖、麦芽糖、阿胶糖、蜜二糖等指标，将分布于我国各地的鼠疫菌划分成17个生态型。

这些传统的分型方法目前仍然还在使用，并具有实际的价值。因此，在鼠疫的自然疫源地调查中，需要对积累起来的菌株进行鉴定。可以按照细菌系统分类手册的要求进行全套的生物化学鉴定，在我国的疫源地中，至少应当测定上述的生化反应并鉴定氨基酸需求以及产生鼠疫菌素能力和对鼠疫菌素敏感性以及色素沉着几个方面毒力特征。

当生物的分子时代来临，人们开始从鼠疫菌的DNA结构中寻找特征，从而建立起高度稳定而又区分明确的分子分型系统。按照一般的逻辑。这一系统应该以上述传统的分型系统为基础，找到造成这种表型差异的DNA基础，然后建立起新的分型系统。然而，早期的分子生物学研究难以在细菌数百万碱基对的染色体结构中发现某一基因的突变，因而，细菌的分子分型方法一开始就进入一条完全不通的途径——寻找整个基因组结构的突出特征。

经过最近20年来不断地发展并淘汰不稳定的技术方法，目前在鼠疫菌的遗传特征鉴定中最常使用的方法有：rRNA基因分型（ribotyping）、脉冲场电泳分析（PFGE）、扩增片段长度多态性分析（AFLP）、可变数目串联重复序列（VNTR）多态性分析以及插入序列（IS）定位分析等。使用这些方法，可以给每一株鼠疫菌都建立起详尽的遗传特征档案。

鼠疫菌全基因组序列的测定与发表，为传统的分子生物学分型方法的会师创造了条件。现在已经了解，甘油阴性的特征为甘油代谢途径中一个基因发生了一段或两段缺失所致，而亚硝酸盐特征的消失在鼠疫菌进化的历史上发生过两次，分别由两个不同的单碱基对突变引起。对传统分型方法的基因注释仍在继续进行，从而使我们掌握了两大类型认识细菌进化与特征的方法：一类反映整个基因组的概貌；另一类反映在鼠疫菌进化史中发生较早，从而在多数鼠疫菌株中具有明显区别的个别基因差异。

从鼠疫菌分型到鼠疫菌遗传特征鉴定主要取得了两个方面的进步。在疫源地分型中，每一个型别只有一套特征，其中任意一个特征的偶然突变，都会使该菌株无法分型甚至误分到另一型别之中。而发展到遗传特征鉴定阶段，每一型别都依据多个不同含义系统中的多套特征划分，因而可以利用多数相符原则将突变的菌株划分入正确的型中。另一主要的进步是，遗传特征鉴定发展到目前的阶段，已经可以精确到确定任何一个菌株是哪一菌株的后裔，从而可以像在“白色粉末事件”后，追踪用于袭击的炭疽芽胞杆菌来源一样，追踪不明鼠疫菌株的来源。

在我国的鼠疫自然疫源地分型中，自然疫源地的型是比鼠疫菌的型更大的概念。鼠疫菌出现了明显的区别特征，只说明疫源地之间具有相对独立的性质，而如果这些相对独立的疫源地具有共同的主要储存宿主和主要媒介，并存在于地理地貌类似的区域之内，这些疫源地仍然属于同一类型，具有类似的流行特征，而且应当采取相似的控制措施。例如，我国的青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地，就包括鼠疫菌为昆仑山型、祁连山型、青藏高原型和冈底斯山型4个类型的疫源地。这些疫源地间存在着宽阔的自然屏障，鼠疫难以相互传播，但具有类似的流行特征。相反，如果鼠疫的自然疫源地具有不同的主要储存宿主，自然也就会有不同的主要媒介，同时又处于不同的自然环境之中，那么，这样的疫源地中必然会出现不同的鼠疫流行规律，对人类构成不同的威胁，需要采取不同的控制措施。这样的鼠疫自然疫源地，应当认为是不同类型的鼠疫自然疫源地。在我国，每一种类型的鼠疫自然疫源地都以其所处的地理区域及其主要储存宿主命名，如松辽平原达乌尔黄鼠鼠疫自然疫源地、青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地等。

因此，在自然疫源地调查的最后，需要将上述各部分的调查结果综合起来才能够最终确定鼠疫自然疫源地的性质和归属，疫源地调查才算完成。