第三节　纳豆激酶口服液

医药制剂中通常用到乳剂，乳剂（也可称为乳状液）是一类由互不相溶的液体组成的分散体系。其中一相由液滴（分散相）组成，另一相称为分散介质（连续相）。最常见的乳状液就是油分散在水中的体系（称为水包油O/W）和水分散在油中的体系（称为油包水W/O）。为了将一种液体分散到另一种互不相溶的液体中并稳定存在，必须加入乳化剂作为第三组分。表面活性剂由于在油-水界面上的定向排列而具有降低界面张力的作用，从而帮助乳剂形成并维持其稳定。表面活性剂的亲水与亲油能力应适当平衡。如果亲水或亲油能力过大，则表面活性剂就会完全溶于水相或油相中，很少存在于界面上，难以达到降低界面张力的作用。1949年，W.C.Griffin率先提出HLB表征表面活性剂亲水基团与亲油基团间的平衡关系。非离子表面活性剂的HLB的范围被设定为0～20，亲油性表面活性剂HLB较低，亲水性表面活性剂HLB较高。亲水亲油转折点HLB为10。HLB小于10为亲油性，大于10为亲水性。作为W/O型乳剂的表面活性剂，其HLB在3～8范围内才具有较好的乳化能力并维持乳剂的稳定。

纳豆激酶存在稳定性差、容易失活等问题，它在pH低于5的环境下很快失活（如胃液中），在高于60℃的情况下也迅速变性。[1]一般而言，纳豆激酶这样的多肽类产品，口服时会面临肠道的三大障碍，即酶的降解、黏液层的扩散屏蔽以及黏膜的吸收屏蔽。[2]若将其制成W/O微乳，乳滴对包裹于内水相及表面活性剂层中的产品具有保护作用，使其免受胃肠道中酸和酶的降解，提高药物在胃肠道中的稳定性。膜透过性差是蛋白多肽类药物口服生物利用度低的另一个重要原因，将此类药物包裹于W/O型微乳后，微乳中油相、表面活性剂等组分可通过提高膜流动性、打开细胞紧密连接[2]等机制显著提高其透膜性能。

一、纳豆激酶口服乳

1.内容物配方

制成1000支。

2.制备工艺

称取处方量的卵磷脂（SPC）、聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH40）、蜂蜡、脱氧胆酸盐（DCA）、中链甘油三酸酯（MCT）组成油相，65℃下溶解后冷却至室温待用。将凝固的油相置于37℃水浴中搅拌融化，在搅拌状态下，精密移取纳豆激酶溶液缓缓注入油相中，继续搅拌1min，即得W/O乳剂。

3.工艺考察

称取处方量的SPC、蜂蜡、DCA和MCT共10g置于25mL烧杯中，于65℃水浴下恒温搅拌至分散均匀，作为油相，放置室温下冷却待用。将凝固的油相于37℃下搅拌融化，并在搅拌状态下将精密移取的2mL纳豆激酶溶液缓缓注入油相中，继续搅拌1min，即得W/O乳剂。

（1）油相中乳化剂用量的考察

对于乳剂来说，选择合适的乳化剂至关重要。SPC的乳化作用强、生物相容性好，且其HLB值约为4，可作为W/O乳剂的乳化剂。因此，我们选用SPC制备纳豆激酶乳剂。乳化剂可吸附于乳滴的界面，有效降低乳滴形成过程中的表面张力或表面自由能，有利于形成和扩大新的界面，使乳化体系保持一定的分散度和稳定性。

[3]

合适的乳化剂用量对乳剂的形成及稳定性至关重要。

制备不同SPC含量的乳剂，各处方的油相中蜂蜡均为5%，DCA均为1%，SPC的质量分别为油相总质量的1%、5%或10%，余量为MCT。水相用量为油相质量的20%，按以上方法制备乳剂。以制剂的外观状态、絮凝状沉淀量、制剂的再分散性和放置稳定性（室温）为指标评价处方优劣。结果见表4-1。

表4-1　SPC用量对制剂性质的影响

由表4-1可知，制剂放置7天后的分层程度随SPC用量增大而减弱，10%SPC带来较好的稳定性。于是，最终确定SPC的质量分数为10%。

（2）油相中蜂蜡用量的考察

蜂蜡是由蜜蜂（工蜂）腹部四对蜡腺分泌，用来构成蜂巢主要成分的蜡状物质。[4]常用来增加油相的黏度，并能增强乳化膜的强度，防止乳滴合并，从而提高油包水型乳剂乳化体系的稳定性。预实验表明，使用不添加蜂蜡的油相无法制备出稳定均一的乳剂，但蜂蜡过多则所制备的乳剂在37℃下也呈固态，不利于制剂在肠道的吸收。因此，需要对蜂蜡用量进行考察。

制备不同蜂蜡含量的乳剂，各处方的油相中SPC均为10%，DCA均为1%，蜂蜡的质量分别为油相总质量的0、1%、3%、5%或10%，余量为MCT；水相用量为油相质量的20%。按以上方法制备乳剂。以制剂的外观形态、流动性（室温、37℃）和放置稳定性（室温）为指标评价处方优劣，结果见表4-2。

表4-2　蜂蜡用量对制剂性质的影响

由表4-2可知，蜂蜡用量为油相总质量的5%时，所制得乳剂在室温下（20℃）呈凝固状态。而在37℃时具有良好的流动性，且放置7天后制剂无分层现象。故将蜂蜡的质量分数定为5%。

（3）油相中DCA用量的考察

脱氧胆酸（deoxycholic acid, DCA）属于游离型胆汁酸，是组成胆汁的重要成分（图4-2）。由于DCA具有疏水基和亲水基，是天然的生物表面活性剂。不仅如此，DCA还可与脂类如磷脂、甘油酯、脂肪酸等形成多种聚集体结构，[5]降低脂肪的表面张力，使脂肪乳化成微粒，并与脂肪酸结合形成水溶性复合物，有利于脂肪酸吸收。但DCA对消化道黏膜有一定刺激作用，其用量不宜过大。基于此特点，我们对乳剂中DCA的用量进行考察。

制备不同DCA含量的乳剂，各处方的油相中SPC均为10%，蜂蜡含量均为5%，DCA的质量分别为油相总质量的0、0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%和3%，余量为MCT，水相用量为油相质量的20%。制备乳剂，以W/O乳剂在水中的自乳化效果作为评价指标，结果见表4-3。

表4-3　DCA用量对制剂性质的影响

由表4-3可知，当DCA含量由0提高到0.5%时，制剂的自乳化能力随之增强。但随着油相中DCA含量的进一步提高，制剂的自乳化效果不再继续改善。同时，由不同阴离子化合物对纳豆激酶活性影响考察结果可知，随着DCA含量的增大，对酶活性的抑制作用增强。综合考虑，确定DCA的用量为油相总质量的0.5%。

4.处方中乳化剂的进一步优化

上述实验已经筛选出自乳化效果较好的纳豆激酶口服W/O乳剂的配方。为便于服用，该乳剂需要灌装于软胶囊或硬胶囊内给药。但是灌装有乳剂的硬胶囊在室温储存时会出现囊壁软化的现象。该现象是由于胶囊内容物中的游离水对囊壁的溶蚀作用所致。对于本研究中的纳豆激酶W/O口服乳剂，由于酶溶液的浓度有一定的上限，所以减少水相的量会导致载药量降低。为解决此矛盾，需要对乳化剂做进一步优化，以期通过稳定乳滴的方式将制剂中的水进行“固定”，从而减弱游离水对胶囊壁的破坏。

表面活性剂的亲水亲油平衡值（HLB）是决定乳剂类型的重要指标。当表面活性剂的HLB值在4～8之间时，有利于W/O型乳剂的形成。[6]而且相比于单一的表面活性剂，表面活性剂复配时的协同效应有利于提高乳化效率。[7]基于此，我们使用复合乳化剂来提高乳剂中乳滴的稳定性。

（1）复合乳化剂的选择

分别以RH40、TPGS、Tween80、Span80或甘油作为附加乳化剂，与SPC复配制备乳剂。各处方中SPC、附加乳化剂和DCA的质量均分别占油相质量的10%、2.5%和0.5%，余量为MCT。水相质量为油相质量的20%。按以上方法制备乳剂。蜂蜡的作用是增加油相的黏稠度，从而提高乳剂的稳定性，但其加入会在一定程度上干扰我们对乳剂成型性的判断，故在实验中未加入，其量以MCT补足。因为未加入蜂蜡，所以所制备乳剂有絮凝出现。我们以乳剂的成乳能力及絮凝后再振荡时的恢复性作为筛选附加乳化剂的指标。结果见表4-4。

表4-4　复合乳化剂种类对制剂成乳的影响[6]

注：以*数量代表各指标所达到的程度，*数量越多，表示此项指标程度越深。

由表4-4结果可知，SPC与RH40作为混合乳化剂时，成乳能力较强且所形成的乳剂性质较稳定，絮凝后也最容易恢复，故选择二者作为纳豆激酶口服乳的复合乳化剂，并对它们的配比进行进一步考察。

（2）混合乳化剂的配比考察

向3个10mL西林瓶中各加入0.30g SPC，并分别加入0.04、0.08和0.15g RH40。之后分别向各瓶中滴加MCT至总质量为3.00g，并于65℃混匀后冷却作为油相。取1.00g油相于37℃水浴中搅拌融化，并在搅拌状态下，移取纳豆激酶溶液200μL缓缓注入油相中，继续搅拌1min，即得澄清的油状液。观察静置一天后的W/O乳剂的分层程度与絮凝状态，并再次振摇，结果见表4-5。

表4-5　复合乳化剂的配比对制剂成乳的影响

注：以*数量代表各指标所达到的程度，*数量越多，表示此项指标程度越深。

从表4-5可知，在较短的观察时期内各处方的成乳能力差别不大，但SPC：RH40=4：1（m/m）时，所得乳剂絮凝后振荡均匀度最佳，且由以下公式[8]计算混合HLB值：

其中，m为溶剂质量。通过计算可知，SPC：RH40=4：1（m/m）所得复合乳化剂的HLB为6.2，较其他RH40的配比更有利于W/O乳剂的稳定。因此，确定复合乳化剂组成为SPC：RH40=4：1（m/m）。

5.以胶囊最大含水量作为指标评价复合乳化剂

合适的乳化剂可通过稳定乳滴等方式降低乳剂中的“游离水”，从而减弱胶囊壁的溶蚀。本实验旨在验证SPC与RH40所形成的复合乳化剂是否有此作用。

（1）复合乳化剂（SPC与RH40）纳豆激酶乳剂胶囊的制备

配方中SPC、RH40、DCA和蜂蜡的质量分别占油相质量的10%、2.5%、0.5%和5%，余量为MCT。加入不同质量的纳豆激酶溶液以使水相质量分别为油相质量的5%、10%、15%、20%、25%、30%。按以上方法制备乳剂并灌装胶囊，获得一系列水相含量递增的纳豆激酶胶囊。

（2）单一乳化剂（SPC）纳豆激酶乳剂胶囊的制备

配方中SPC、DCA和蜂蜡的质量分别占油相质量的10%、0.5%和5%，余量为MCT。加入不同重量的纳豆激酶溶液以使水相质量分别为油相质量的5%、10%、15%、20%、25%、30%。依法制备乳剂并灌装胶囊，获得一系列水相含量递增的纳豆激酶胶囊。

上述每个配方制备50枚0号肠溶胶囊，分别装入玻璃瓶中密封，并于室温下放置30天。每天观察并记录胶囊壁的开始软化时间和软化胶囊的数量。结果见表4-6。

表4-6　纳豆激酶口服乳胶囊最大含水量的考察结果

注：以*的数量代表囊壁软化程度，数量越多，表示囊壁软化越明显。

由表4-6可知，当使用SPC与RH40作为复合乳化剂时，相比与仅使用SPC作为乳化剂，胶囊能够稳定保存的最大含水量明显提高。所以确定优化后的乳化剂质量比为SPC：RH40=4：1（m/m）。

6.乳剂对纳豆激酶热稳定性的影响

分别取酶活度为1000、100FU/mL的纳豆激酶溶液和1000FU/mL的纳豆激酶W/O乳剂于70℃下放置0.17、0.5、1、3h。放置后的乳剂使用1%Tween80的磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L, pH 7.4）进行水化。将乳剂水化物和纳豆激酶溶液分别进行体外溶解血凝块实验，记录各个时间点的溶栓率，以评价纳豆激酶制备为乳剂后在热稳定性方面的改善，结果见图4-3至图4-6。

由图4-3可知，放置0.17h后，溶液的溶栓速率在前4h内比乳剂稍快。这可能是由于溶液和制剂在高温中放置时间很短，二者的酶活性丧失均很少。乳剂水化后，相比于溶液，其中的酶需要经过一定的释放过程才能作用于血凝块，故溶栓速率在前4h表现得延迟。当溶液和乳剂在70℃下的放置时间延长到0.5h时，乳剂的溶栓速率在前8h均快于溶液（图4-4）；随着放置时间延长到1h时，纳豆激酶溶液的10h溶栓率为9.2%，而乳剂10h溶栓率则为50.6%（图4-5）；当放置时间进一步延长到3h时，纳豆激酶溶液中的酶已经完全失活，而乳剂的10h溶栓率为31.5%（图4-6）。上述结果表明纳豆激酶制备为乳剂后，其热稳定性有明显改善。

7.乳剂对纳豆激酶放置稳定性的影响

配制相同酶活性的纳豆激酶溶液与纳豆激酶W/O乳剂，将溶液与乳剂分别于4℃或室温（20℃）下放置。30天后，运用纤维蛋白平板法测定酶的活性，评价制备乳剂对纳豆激酶放置稳定性的影响。结果见图4-7。

由图4-7可知，纳豆激酶溶液在室温下放置1个月后残余酶活为13.7%，在4℃则为60.0%；纳豆激酶乳剂在室温下放置1个月后残余酶活为61.0%，在4℃条件下则高达94.0%。说明制备为乳剂能够显著提高纳豆激酶的放置稳定性。

8.纳豆激酶W/O口服乳剂的抗血栓作用

将所制备的纳豆激酶乳剂或不含药空白乳剂（使用蒸馏水代替纳豆激酶溶液）灌入小鼠专用肠溶小胶囊，得到纳豆激酶乳剂胶囊和空白乳剂胶囊。纳豆激酶冻干粉用玉米淀粉以质量比为1：1的比例与纳豆激酶混合均匀后，灌入小鼠专用肠溶小胶囊，得到纳豆激酶粉末胶囊。

将健康雄性Wistar大鼠35只，称重后随机分7组，每组5只，组内编号。各组分别为：空白组、灌服与给药组数目相同的空胶囊、纳豆激酶乳剂胶囊高剂量组（NK-ECa-H，14.4 kU/kg）、纳豆激酶乳剂胶囊低剂量组（NK-ECa-L，7.2 kU/kg）、纳豆激酶冻干粉胶囊高剂量组（NK-PCa-H，14.4 kU/kg）、纳豆激酶冻干粉胶囊低剂量组（NK-PCa-L，7.2 kU/kg）、纳豆激酶乳剂直接灌胃组（NK-E，14.4 kU/kg）、空白乳剂胶囊组（ECa，给药剂量与乳剂高剂量组相同，但制剂中未加入纳豆激酶）。

每日给药1次，连续10日，隔日称重，观察记录大鼠的活动、精神状态、食欲、肛门周围干燥与否等情况。在给药后第11日进行手术造栓，计算相对栓重。最后处死动物，摘取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、结肠，对脏器进行称重并制作病理切片。

（1）体重变化

根据下式计算各组大鼠的体重增长百分率In%。

In%=（mn-mi）/mi×100%

式中：mn为给药后第n天大鼠的平均体重；mi为第1天给药时大鼠的平均体重。

各组大鼠活动、精神情况均正常，无蜷缩、毛发脱落及死亡现象。与对照组相比，各试验组大鼠进食及排便等未见异常。以体重增长百分率为纵坐标对给药后天数作图，结果见图4-8。

由图4-8可知，随着时间的延长，各组大鼠体重均有所增加。在所有观察的时间点上，各组之间在体重增长无显著性差异（p＞0.05）。

（2）抗栓率的计算

给药后第11天，将大鼠以3.5%水合氯醛进行腹腔麻醉（1mL/100g），手术分离双侧颈总动脉。在双侧颈总动脉下各垫一条1.0cm×3.0cm的塑料薄片，用浸渍有50μL FeC13溶液（10%，m/v）的滤纸条（1.0cm×1.5cm）覆盖双侧颈总动脉。20min后取下滤纸条，剪下变色区域用生理盐水洗净，滤纸吸干水分后测量其长度，并用分析天平精密称重。

单位长度血栓的质量记为相对栓重（mg/cm），并以下述公式计算抗栓率。

抗栓率%=（mn-mS）/mn×100%

式中：mn为对照组平均相对栓重；mS为给药组平均相对栓重。

计算抗栓率，并对结果进行统计学分析，结果见表4-7。

表4-7　不同给药组抗栓率结果及统计学分析

结果表明，与ECa组相比，各种纳豆激酶制剂（NK-ECa、NK-PCa和NK-E）均有显著的抗栓效果（p＜0.05）。NK-ECa和NK-PCa的抗栓效果均显著强于NK-E（p＜0.05）。NK-ECa的抗栓效果显著强于NK-PCa（p＜0.05）。对于剂量不同的给药组，NK-ECa-H的抗栓效果显著优于NK-ECa-L（p＜0.05）。但NK-PCa-H的抗栓效果与NK-PCa-L相同（p＞0.05）。

实验证明，NK-ECa的抗栓活性可能是因为纳豆激酶在肠道吸收[9，10]的缘故。纳豆激酶W/O乳剂进入胃中后即会释放药物，这些药物在酸性环境中产生了降解，导致进入肠道并被吸收的纳豆激酶量显著降低。相比于纳豆激酶粉末胶囊，纳豆激酶W/O乳剂胶囊显示出更优的抗栓活性。推测纳豆激酶W/O乳剂的这种增效作用主要归功于其处方中的磷脂和胆酸盐对消化道黏膜的结构和流动性的改变。[11]一方面，磷脂等脂类可以扰乱小肠上皮细胞表面的黏液保护层，改变肠道黏膜的流动性，[12]从而帮助药物吸收。另一方面，胆酸盐能够溶解磷脂膜，通过调节肠上皮细胞间的紧密连接，为药物打开进入体内的通道。[13]胆酸盐能促进蛋白多肽类物质的肠道吸收已有大量文献报道。如：①甘胆酸钠可促进鲑鱼降钙素从大鼠的小肠吸收，血钙降低程度由不加甘胆酸钠的5.2%增至22.1%；[14]②1%牛磺胆酸钠可使鲑鱼降钙素体外透过大鼠肠黏膜能力增加14倍；[15]③大鼠空肠在体实验表明，1%熊脱氧胆酸盐（UDCA）和1%的鹅脱氧胆酸盐（CDCA）可促使生长抑素八肽的吸收分别增大17倍和77倍。[16]因此，纳豆激酶W/O乳剂胶囊中的胆酸盐也可能通过类似机制促进纳豆激酶的肠道吸收。

纳豆激酶W/O乳剂胶囊比纳豆激酶粉末胶囊疗效更好的原因还可能在于，W/O乳剂进入体内后所产生的包裹作用，这可以改善蛋白多肽类物质的口服吸收生物利用度。[17]将纳豆激酶W/O乳剂于37℃下用pH 6.8的人工肠液[3]进行水化，立即使用显微镜观察（图4-9）。可发现粗大（浑浊）的粒子，其粒径约为15μm，并且粒子内部分布着水相区域和油相，即类似于W/O/W的结构。由于镜下观察难以维持37℃的环境，因此，粒子内部相对固化。推测W/O/W形式的乳滴粒子可能是纳豆激酶W/O乳剂进入肠道后的第一种转化形式，它有助于纳豆激酶在小肠环境中的稳定和吸收。而纳豆激酶粉末肠溶胶囊在肠道中则不存在这种保护及促吸收的机制。

上述机制还可以解释：为何纳豆激酶W/O乳剂胶囊高、低剂量组之间有药效学上的差异，但纳豆激酶粉末胶囊高、低剂量组间却没有观察到差异。即纳豆激酶粉末进入肠道后，只能通过有限的吸收途径（如细胞间隙和细胞吞噬）吸收，而口服低剂量的纳豆激酶粉末胶囊可能就已经使这种吸收途径饱和。但到达肠道的纳豆激酶W/O乳剂却能借助胆酸盐的吸收促进作用和W/O/W形式的乳滴粒子包裹作用等实现更大程度的吸收。

二、W/O乳剂表面活性剂的选择及制剂稳定性

在实验研究中，我们所采用的SPC的HLB约为4，所以可用于W/O型乳剂的制备。当使用SPC与RH40作为复合乳化剂时，所制得乳剂的稳定性优于仅使用SPC者。一方面，这可能是由于复合乳化剂的HLB约为6，更加接近MCT的HLB（约为8），从而更易使乳剂稳定。另一方面，SPC作为亲油性表面活性剂，其在乳化过程中或乳化之后会逐渐转移到油相直至平衡，而附加表面活性剂（RH40）可以延缓这种平衡的建立或改变平衡点，从而有助于乳剂的稳定。[18]

我们在实验中发现，相比于甘油、Span80和Tween80，RH40作为附加乳化剂时能提供最好的稳定效果。这可能是因为RH40分子结构中包含3条较长的亲水链段，并且其亲水链末端还连接有较长的疏水脂肪链（图4-10）。因此，可以牢固“吸附”于W/O乳剂的界面区（图4-11），降低表面自由能，帮助维持乳滴粒子的稳定。[19]而甘油为小分子，不具有此作用；Span80仅有1个疏水区和1个亲水区；Tween80的4条亲水链中只有1条末端连接有疏水区。因此，甘油、Span80和Tween80均没有RH40稳定乳剂的作用强。

在乳剂的连续相（即油相）中添加蜂蜡作为增稠剂，从而降低了乳剂的分层/沉降，也减轻了进一步的絮凝。通过控制蜂蜡的比例（占油相质量的5%），所制备出的W/O乳剂为在室温（20℃）下黏度较大的半固体，而在37℃下为流动性很好的液体，这样既能使乳剂在放置时更加稳定，又保证其被口服后在胃肠道能够较好地水化。

三、制备为W/O乳剂后纳豆激酶稳定性提高的可能原因

蛋白质分散于水中时，其表面的亲水基团会吸引水分子在其外层包裹而形成一个约3个水分子厚度的水复合膜。膜的各层水分子运动速度不同，由外至内逐渐变慢，紧贴蛋白质表面的一层水分子与蛋白分子以氢键或静电力结合在一起，厚度约为0.3～0.4 nm。[20]蛋白分子表面的水复合膜是其在水中稳定存在的重要条件。[21]而在蛋白质结构的内部，存在有空隙，即蛋白分子内部体积的25%仍未被氨基酸占据，蛋白质通过疏水作用力进行折叠从而对维持其空间稳定起着重要作用。蛋白质的分子构象是指蛋白质分子中所有原子在三维空间中的排布，也即为蛋白质分子的空间结构。多肽链中的一切原子，由于主链骨架上单键的旋转，产生了不同的空间排列，就是多肽链的不同构象，蛋白的功能可由其构象决定。在加热等情况下，多肽链会产生旋转，使得蛋白的构象发生改变，从而影响了蛋白的功能（活性），并且这种热变性往往是不可逆转的。[22]同样，在加热的情况下，蛋白表面水复合膜中的水分子动能增强，离去趋势增加，使得蛋白分子易于受到溶液中的离子攻击而导致二级或三级结构改变。[23]此外，对于蛋白溶液而言，气液界面的存在也会通过暴露蛋白疏水区等方式导致蛋白结构损伤。[24]

纳豆激酶分子的结构如图4-12所示，其活性中心在分子内部的疏水区。[25]因此，该疏水区如果因为气液界面等方式被损伤后，活性将大大降低。

将纳豆激酶包裹于W/O乳剂中后，其热稳定性大大加强。原因可能有以下几点：①纳豆激酶包封于乳剂内部后，相比于溶液形式，不存在空气-水界面，蛋白不会受到气液界面的损伤；②W/O乳剂中乳滴的内表面有RH40形成的亲水链段，这些链段对蛋白分子具有保护作用。[24，26]油-水界面上的磷脂头部与纳豆激酶分子间有一定的氢键作用[27]和电荷作用（水相pH为6.5，该条件下SPC荷负电，纳豆激酶荷正电，彼此有电荷作用力），更加深入到水相中的RH40分子的亲水链则会“络合”纳豆激酶分子。两方面的作用可能使纳豆激酶分子更多地聚集于界面上被锚定，从而在受热的情况下不容易发生三级结构的改变（图4-13）。另一方面，RH40

还会阻碍溶液中离子对纳豆激酶的进攻，从而减少纳豆激酶的降解。

四、荷负电物质对纳豆激酶体外溶栓活性的影响

纳豆激酶为荷正电的丝氨酸蛋白酶，其表面有较多的碱性氨基酸基团，因此可能与荷负电的阴离子化合物通过静电力结合。基于此，我们通过体外血栓溶解实验考察阴离子化合物加入对纳豆激酶活性的影响，为制剂中辅料筛选提供重要的参考依据。

1.纳豆激酶磷脂复合物的体外溶栓研究

（1）不同配方的纳豆激酶磷脂复合物的制备

65℃水浴中，分别用1mL叔丁醇溶解口服SPC（100mg）、PS（100mg）或混合磷脂（口服SPC：PS=50mg：50mg）。待磷脂完全溶解后，于37℃搅拌条件下以约0.8mL/s的速度向此体系中注入2mL预热至相同温度的纳豆激酶溶液（20 000FU/mL），孵育5min，制得不同配方的纳豆激酶磷脂复合物粗品。将这些粗品进行真空冷冻干燥，即得不同配方的纳豆激酶磷脂复合物。

（2）不同配方纳豆激酶磷脂复合物的体外溶栓活性检测

将所得的纳豆激酶磷脂复合物冻干粉精密称重，换算其单位质量所含的酶活度。取一定量的复合物粉末溶于生理盐水，配成相应的酶活力（500FU/mL）的溶液。以500FU/mL的纳豆激酶冻干粉溶液作为对比，进行体外血凝块溶解实验，结果见图4-14。

由图4-14可知，纳豆激酶制成磷脂复合物后，其体外溶栓活性略微下降，且不含PS的复合物活性下降幅度大于含有PS的。

2.小分子阴离子化合物

配制十二烷基硫酸钠（SDS）、癸酸钠（SC）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）或脱氧胆酸钠（SD）浓度分别为2%（m/v）和0.2%（m/v）的纳豆激酶溶液（500FU/mL），见表4-8。将所配制纳豆激酶溶液于体外进行血凝块溶解实验，比较阴离子化合物的加入给纳豆激酶溶栓活性带来的影响，结果见图4-15和图4-16。

表4-8　添加物的浓度、相对分子质量及与纳豆激酶的物质的量（摩尔）之比

由图4-15及4-16可知，阴离子化合物在0.2%的浓度下，抑制能力为SDS＞EDTA-2Na＞SD≈SC。2%的浓度下，抑制能力为SC＞SDS＞EDTA-2Na＞SD。0.2%的SD和SC对纳豆激酶的活性基本无影响，它们对纳豆激酶的活性抑制能力随其浓度的上升而显著提高。SDS和EDTA-2Na的酶活抑制作用亦随浓度的上升而提高。

3.高分子阴离子化合物

（1）纳豆激酶与不同浓度的肝素结合

将500FU/mL纳豆激酶溶液分别与50IU/mL、500IU/mL、5000IU/mL的肝素溶液混合，将所得到的一系列混合溶液进行体外血栓溶解实验，比较肝素的加入对纳豆激酶酶活性的影响，结果如图4-17所示。

表4-9　肝素的活度、相对分子质量及与纳豆激酶物质的量（摩尔）之比

肝素为多聚阴离子物质，具有增强抗凝血酶 Ⅲ活性、激活肝素辅助因子 Ⅱ、促进纤溶系统激活及抗血小板聚集的作用，常用于血栓性疾病的治疗。[28]在体外，由于离体血凝块中缺乏肝素的作用底物凝血酶，故无法溶解血凝块。由图4-17可知，随着肝素分子与纳豆激酶物质的量（摩尔）之比例的增大（最高达到1：700），纳豆激酶的溶栓能力显著下降。原因可能是大量肝素所带的负电荷作用于纳豆激酶分子上的正电荷，尤其是与赖氨酸残基结合，所形成的保护层阻碍了纳豆激酶与外界的接触。

（2）纳豆激酶与不同浓度的聚谷氨酸结合

配制不同浓度的高分子聚谷氨酸（PGA-H，相对分子质量500 000～800 000）纳豆激酶溶液或低分子聚谷氨酸（PGA-L，相对分子质量10 000～100 000）纳豆激酶溶液，其中纳豆激酶酶活度为500FU/mL，溶液中PGA的浓度及与纳豆激酶的摩尔比见表4-10。将各溶液于体外进行血栓溶解实验，比较不同相对分子质量和浓度的PGA对纳豆激酶酶活性的影响，结果如图4-18和图4-19所示。

表4-10　聚谷氨酸的浓度、相对分子质量及与纳豆激酶物质的量（摩尔）之比

聚谷氨酸溶液的黏度很高，且与其相对分子质量成正比。PGA-L为低分子聚谷氨酸、PGA-H为高分子聚谷氨酸。由图4-19可知，PGA-L浓度为0.5mg/mL、5mg/mL时，纳豆激酶与它的物质的量（摩尔）之比在1：1～10时，纳豆激酶活性基本不变，表明PGA对纳豆激酶基本没有活性抑制作用。当浓度增大，物质的量（摩尔）之比增大时，多个PGA-L分子聚集包裹在纳豆激酶分子周围；同理，如图4-19所示，高聚合度的PGA-H与纳豆激酶物质的量（摩尔）之比在1：1左右时，能对纳豆激酶起到极强的包裹作用，使得纳豆激酶的释放减慢。由于聚谷氨酸分子对纳豆激酶的酶活抑制作用较弱，而聚谷氨酸分子侧链的阴离子羧基又可能通过电荷作用包裹在纳豆激酶分子周围，防止酸、微生物与金属离子等对酶的进攻，对酶起到保护作用。

五、实验因素（血凝块法）对纳豆激酶体外溶栓活性的影响

1.不同凝血与放置条件下血凝块对纳豆激酶、尿激酶体外溶栓活性的影响

现在已知的纳豆激酶的溶栓机制（图4-20）主要有以下4点：[29]

注：PAI-1是凝血酶原激活因子的抑制因子

①将交联纤维蛋白直接水解成小肽和氨基酸发挥溶栓作用；

②促进血管内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂（t-PA），t-PA催化纤溶酶原转变成纤溶酶，溶解血栓。

③促使体内尿激酶原转变为尿激酶，从而激活纤溶酶原，所生成的纤溶酶可溶解血栓。

④在体外具有降解纤溶酶原激活剂的抑制剂PAI-1的作用。PAI-1可通过水解t-PA而减少纤溶酶的生成。PAI-1的失活导致t-PA增加，使生成纤溶酶的量增加，从而加速血栓溶解。

其中，纳豆激酶所具备的直接降解交联纤维蛋白的特性对于其体外溶栓作用贡献最大。而尿激酶的溶栓活性的发挥则主要依赖于其对纤溶酶原的直接激活，但陈旧血栓中缺乏纤溶酶原，所以纳豆激酶对陈旧血栓的溶解效果远较尿激酶强。[30]

室温下自然放置的血凝块被空气中氧、微生物等降解，其中的交联纤维蛋白网会变性而导致致密程度降低，有利于溶栓药物的进入。所以血凝块放置时间越长，纳豆激酶对其溶解作用越强。对于尿激酶的溶栓过程而言，除了以上的原因，还可能是血块变得疏松有助于释放血块中原有的纤溶酶原，尿激酶激活纤溶酶原产生更多的纤溶酶，从而使溶栓效果加强。

比较尿激酶对室温和37℃下自然凝固血块的溶解能力，发现尿激酶对37℃下生成并保存的血块溶解作用较弱。但经过了抗氧抑菌处理之后，两温度下的这种差距明显减小。分析产生这一现象的主要原因是，即使在体外凝血与溶栓的动态平衡也依然存在。37℃比室温更有利于凝血与溶栓的进行，新血块内外的纤溶酶原也在此适宜的温度中被消耗得更完全，尿激酶缺少反应底物，故溶栓效果弱。

纳豆激酶对室温下放置20h和5天的血凝块溶栓作用之间的差距在通过抗氧抑菌处理后基本被消除。这说明，在室温下，影响血凝块性质的主要因素是氧和微生物。然而在37℃下，通过抗氧抑菌处理后，纳豆激酶对新旧血凝块溶解效果的差距不仅没有消除反而进一步加大，而且是旧血凝块更加难以被溶解。说明在37℃下，除了氧和微生物对血块性质的影响外，还有更复杂的因素会改变血凝块的性质。另一方面，过于复杂的影响因素也不利于我们进行纳豆激酶溶栓活性的体外评价。因此，在之后的实验中选择室温作为血凝块的生成及保存条件。

2.温度和pH对纳豆激酶体外溶栓结果的影响

对于酶催化反应来说，温度起着重要作用。温度对酶促反应的影响主要有两个方面：一是温度对酶稳定性的影响，即酶热变性失活作用；二是温度对酶促反应本身的影响。一般情况下，随着温度的升高，酶催化反应速度加快，这与一般的化学反应一样。但是酶作为一种有活性的蛋白，具有特定的空间结构，温度过高，则蛋白质的空间结构难以维持，会导致热变性。所以，在一定的温度范围内，酶反应达到最大的速率的温度，则为酶促反应的最适温度。[31]另一方面，选择37℃作为反应温度可模拟人体内部环境。然而对于纳豆激酶的体外溶栓，底物不同，反应的各项参数也不同。董志奎[32]研究发现，纳豆激酶以TAME（对甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯）为底物时的最适反应温度为37℃，而高大海[33]以纤维蛋白平板法、倪剑锋[34]以Folin显色法考察了纳豆激酶的活性，发现其在55℃时的相对酶活最高。我们通过血凝块溶解实验发现，纳豆激酶体外溶栓的最适温度为37℃。

同样，酶促反应的pH也是影响酶活力的重要因素。在纳豆激酶体外溶栓实验中，pH的选择既要符合酶自身的活性酸碱范围，又要能与体内反应相关联。文献报道，纳豆激酶体外酶促反应的最适pH在8.6左右，[32]而人体血液的正常pH一般在7.35～7.45，肿瘤组织周围微环境中的pH一般在6.5左右，癌症病人的血液则几乎均呈酸性。[35]因此我们考察了纳豆激酶在pH 6.0、pH 7.4和pH 9.0三个pH环境中的溶栓率，发现纳豆激酶在pH 7.4和pH 9.0环境中的溶栓活性并没有显著差异（图4-21）。

3.磷脂复合物对纳豆激酶酶活性影响结果的分析

纳豆激酶制成磷脂复合物后，不含PS的复合物其活性略低于含PS的复合物，原因可能在于复合物制备过程对酶活性有一定的破坏，而荷负电的PS可通过静电作用与荷正电的纳豆激酶结合，从而在加热或冷冻过程中对酶的空间结构进行保护，减少酶活性的下降。但PS与纳豆激酶的结合也会在一定程度上减弱纳豆激酶对底物的催化作用，也许由于PS与纳豆激酶的结合在空间上没有对纳豆激酶的活性位点造成大的阻碍，所以这种削弱作用并不明显。也有另一种可能，即纳豆激酶-PS复合物与底物作用时，纳豆激酶与磷脂的结合被打开，重新与亲和力更强的纤维蛋白作用，即磷脂与纳豆激酶的结合是一种可逆性结合。猜测这种可逆性结合可能是通过荷正电的纳豆激酶与荷负电的PS之间的静电力以及纳豆激酶分子与磷脂分子间的范德华力，[36]当复合物与酶的底物反应时，这种结合就能被替换，而不会掩蔽酶的活性基团导致酶活下降。

综上可见，磷脂复合物的形成可以减弱纳豆激酶在制剂过程中被破坏并维持其活性。

4.考察聚谷氨酸对纳豆激酶活性影响的意义

很多大分子化合物已证明具有稳定蛋白质的作用。其稳定机制可能包括大分子的表面活性、优先排除、与蛋白分子相互作用的空间隐蔽、黏度提高限制蛋白质运动等。[37]

聚谷氨酸是一种天然的水溶性极强的阴离子聚合物（图4-22），易被生物降解，[38]故可用于增稠剂、保护剂[39]、缓释材料、药物载体[40]、生物黏合剂固化[41]、可生物降解的纤维、高水吸收的水凝胶、生物高分子絮凝剂[42]以及重金属吸收剂[43]等多个领域。

γ-聚谷氨酸作为纳豆激酶发酵液中的黏性副产物，[44]在食用纳豆时对纳豆激酶免受胃中强酸破坏起保护作用，故可知聚谷氨酸本身对纳豆激酶活性没有破坏作用。此外，作为一种碱性丝氨酸蛋白，纳豆激酶表面具有多个荷正电的氨基酸残基，而γ-聚谷氨酸侧链上存在大量阴离子羧基，二者通过静电力结合。聚谷氨酸在纳豆激酶周围形成保护层，其表面大量的亲水基，能与水形成牢固的水化膜，[45]阻止消化道中的强酸和酶对纳豆激酶结构的破坏以及分子之间的相互聚集，从而维持纳豆激酶的空间构象，保持纳豆激酶的活性。同时，聚谷氨酸在体内的生物可降解性[46]也能很好地实现被包裹的纳豆激酶的顺利释放，不影响纳豆激酶到达靶位点的吸收。