第二节 纳豆激酶的提纯
纳豆发酵先获得纳豆粉，再从纳豆粉纯化出纳豆激酶。纳豆激酶提取、分离、过滤设备见图3-6至3-8。
一、纳豆激酶的提取
方法一 固体发酵得到的纳豆发酵粉用0.1 mol/L NaCl溶液于4～10℃搅拌提取，过滤，滤液加0.03%CaCl2，低温超滤浓缩，加冷酒精至乙醇含量达75%～[4]
80%，得纳豆激酶沉淀。
图3-6 纳豆激酶提取设备
图3-7 纳豆激酶分离设备
图3-8 纳豆激酶过滤设备
方法二 将纳豆激酶发酵液过滤，6000 r/min离心20min，于65%（NH4）2SO4条件下将离心后的发酵液进行超声波辅助盐析，盐析后静置5min，然后再离心，得沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，即得纳豆激酶粗酶液。
方法三 用4℃的蒸馏水和纳豆以1：1（蒸馏水体积/纳豆质量）的比例混匀，捣碎，得到泥状物。4℃，6000 r/min离心20min，取上清液，冷冻干燥得到纳豆激酶粉末。
方法四 将纳豆激酶发酵液用0.1μm陶瓷膜进行固液分离，透析液用截留相对分子质量为10 000的超滤膜进行浓缩，得到浓缩液，冷冻干燥得纳豆激酶粉末。
二、分离纯化
分离纯化是纳豆激酶的生产和研究中最关键的步骤。纳豆激酶作为一种溶栓物质，对纯度要求很高，分离纯化的难度也相对较大。已用于分离纳豆激酶的方法有各种柱层析法、膨胀床吸附分离方法等。[5]目前，纳豆激酶的分离纯化工艺采用最多的仍是传统的蛋白质纯化方法，包括有机溶剂沉淀、盐析、离心、凝胶色谱柱纯化等方法。
1998年的美国专利[6]报道了两种纳豆激酶纯化工艺：
①从发酵液中用乙醇分级沉淀。分别用浓度为50%和75%的乙醇处理，离心后沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中，采用丁基琼脂糖凝胶疏水层析柱，洗脱收集活性部分，脱盐、浓缩后过阴离子交换柱（Mono-Q），洗脱液再以烷基琼脂糖凝胶柱分离，得到收率为22.0%的纳豆激酶。②从丁基琼脂糖凝胶洗脱，得到的活性部分作为原料，采用阳离子交换树脂柱分离，得到的活性洗脱部分再采用Sephacryl S-200分子筛柱分离，得到纯品，收率为18.0%。
1994年日本专利[7]采用（NH4）2SO4沉淀。经丁基琼脂糖凝胶柱后用G-25柱脱盐，再上Sephacryl S-200分子筛柱，收率为50%。以上专利的纯化方法都经过了三步柱层析。
液态发酵生产纳豆激酶分离纯化的路线[8]如图3-9所示：
图3-9 液态发酵生产纳豆激酶分离纯化的路线
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，称为盐溶。当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，此时称为盐析。盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。盐析法分离纯化纳豆激酶的操作步骤如下：将纳豆激酶粗酶液用（NH4）2SO4盐析，根据盐析曲线图，先调节粗酶液的（NH4）2SO4浓度为较低浓度，4℃冰箱静置过夜，离心，去除沉淀。上清液调节粗酶液的（NH4）2SO4浓度为较高浓度，再于4℃冰箱静置过夜，离心，去上清液，沉淀用蒸馏水溶解。得到的即为经过去除杂蛋白的酶液，将酶液脱盐，浓缩，并考察盐析操作对纳豆激酶活力的影响。
其基本工艺流程是：离心除菌→盐析→超滤浓缩→凝胶过滤层析脱盐→离子交换层析或疏水层析。一般是将多种层析方法结合起来使用。
上述实验采用了（NH4）2SO4沉淀、凝胶层析和离子交换层析的方法对纳豆激酶进行分离纯化。其中凝胶层析又称为分子筛层析或排阻层析，是利用分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。
离子交换层析主要是对凝胶层析后的酶液进行精制。其步骤分为：
①进样。将低温保存的经过预处理的纳豆激酶样品溶液进样于层析柱中。
②洗杂。用样品缓冲液继续洗脱，洗掉不能吸附的色素等物质，收集穿透峰并检测有无纳豆激酶活性。
③洗脱。采用阶段洗脱法，洗脱过程中调节洗脱缓冲液（磷酸盐缓冲液）的比例，每一阶段进行到电导值恒定为止。最后用蒸馏水洗柱。
④收集。以紫外分光光度法检测洗脱液，分别收集各阶段洗脱峰。
⑤酶活检测。用纤维蛋白平板法检测洗脱液纳豆激酶酶活，找到并收集具有活性的洗脱峰。
⑥酶液的脱盐及浓缩。将收集的具有活性的洗脱峰溶液透析脱盐，透析外液为蒸馏水。
纳豆激酶发酵液泵入膨胀床进行吸附→对膨胀床进行冲洗→纳豆激酶的洗脱→在位清洗。该方法具有快速分离纯化的特点。
影响膨胀床吸附效果的重要因素有发酵液的pH和电导率。在pH 5.5～7.0范围内，随着pH的降低，纳豆激酶与吸附剂的作用增强。当pH为6.0时，纳豆激酶的回收率最高。但pH过低，会增加杂蛋白的污染，降低纳豆激酶的纯度。发酵液的电导率过高，纳豆激酶不能被吸附。当发酵液经稀释后电导率降低，纳豆激酶的吸附量增加。当电导率低于6.2 mS/cm时，平衡吸附量变化不大。
以下是纳豆激酶分离过程的一般处理流程（图3-10）：
图3-10 膨胀床吸附技术在下游分离过程示意图
纳豆激酶前萃取的动力是带正电荷的纳豆激酶和带负电荷的AOT（丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠）亲水磺酸基团之间的静电引力作用。可在50mL具塞三角瓶中进行萃取和反萃实验，设置体积都为5mL的萃取水相和有机相。在萃取实验中，有机相为50 mmol/L的AOT-异辛烷反胶团AOT溶液，水相为含20 mmol/L pH 3.0～7.0醋酸或Tris-HCl缓冲液、1.0mg/mL枯草菌溶素、0.1 mol/L NaCl水溶液。以240 r/min的速度在摇床上振荡，将温度控制在20℃。再以4000 r/min的速度离心5min，以获得分组。对照实验以不含蛋白质的水相同时进行。然后取有机相与反萃水相等体积混合，在35℃的条件下以240 r/min的速度在摇床上振荡，再以4000 r/min的速度将混合液离心5min，以获得分组。
实验中要综合考虑反萃取率和酶活力之间的关系及各种影响因素。
①在萃取过程中，萃取水相中的pH、离子强度会对纳豆激酶的反萃取率产生影响，pH升高蛋白质回收率明显下降，纳豆激酶活力的回收率在pH 6.0～6.5范围内达到最大，约为80%。
②研究表明，水相中添加异丙醇会强化反萃取过程，极大地提高纳豆激酶的反萃取率。随着异丙醇浓度的增加，蛋白质和酶活力的回收率同步增加。
③在前萃取过程中，有机相和发酵上清液体积比越大，酶活回收率和蛋白回收率越高，以二者等体积混合为宜。
④温度因素的影响。前萃取过程和反萃取过程的最适温度分别是25和35℃。
⑤反萃取时负载有机相与反萃水相等体积混合效果最好，酶活性的回收率超过80%。
⑥反萃取时间选择。随反萃取时间的延长，反萃取率逐渐升高，大约在20min左右达到平衡。但是反萃取时间过长，使酶活回收率下降。研究表明，以纳豆激酶的粗提液为水相与反胶团溶液按比例混合，在10～35℃下进行萃取，使纳豆激酶进入反胶团溶液。再在20～45℃下进行反萃取，当异丙醇浓度为20%，反萃取时间为10min时，纳豆激酶酶活力回收率最高，并且同时具有浓缩和脱色作用。[10，11]
此方法中的双水相萃取具有可以直接处理发酵液的优势，同时把金属螯合亲合作用引入到双水相系统，加强了分配的选择性。金属螯合双水相亲和分配法具有选择性好、分离条件温和、与生物质兼容性好等特点。但该法的缺点是Cu2+容易脱落，对人体造成危害。
金属螯合双水相亲和分配技术对于表面具有His-Gly-His位点的天然蛋白质或带有组氨酸标签的基因工程蛋白具有高度的亲和作用。纳豆激酶是由275个氨基酸残基组成的单链多肽。氨基酸一级序列结构中存在-His-Gly-Thr-His-结构，可利用二价或三价金属离子对该结构产生螯合亲和作用，再引入双水相分配系统进行分离。所以，应用IMAP技术进行纳豆激酶的分离具有可行性。
实验对PEG4000的羟基进行活化，以亚氨基二乙酸（IDA）为螯合剂，制取含有Cu2+的金属螯合亲和配基PEG-IDA-Cu2+；以PEG（聚乙二醇）和羟丙基淀粉（PES）形成双水相，用于直接处理纳豆激酶的发酵液，经过两次分配分离流程回收纳豆激酶。并考察聚合物（PEG、PES）的相对分子质量、各自浓度、亲和配基（PEG-IDA-Cu2+）加入量、溶液的pH以及纳豆激酶发酵液加入量等因素对纳豆激酶分配的影响，得到较优的分配体系为：PEG-IDA-Cu2+，5%；相比1.2；pH 8.2；发酵液加入量15%。经过两次分配，纯化因子达到了3.52，总收率为81%。证明用金属螯合双水相分配技术从发酵液中直接分离纳豆激酶是可行的，[12]见图3-11，3-12。
此方法是在发酵过程中利用泡沫分离法对蛋白质进行富集分离，达到发酵与分离相耦合，可解除终产物反馈抑制作用，缩短生产周期，提高酶活。
效率较高，可进行连续化生产，缩短时间，节约成本，适合大规模生产。
图3-11 双水相亲和分配技术分配纯化纳豆激酶过程示意图
图3-12 温度诱导双水相金属螯合物亲和分离纳豆激酶过程示意图[12]
超滤法以压差为驱动力，是一种有效的膜分离技术。按照截留相对分子质量的大小，可分离0～1000 000的大分子物质。比膜孔小的物质和溶剂一起透过膜，而较大的物质则被截留。
超滤技术具有如下优点：①在操作过程中无相变化。因此，不会改变产品的性能和活性，纯化提取条件温和；②超滤设备和工艺较其他分离方法简单，耗能低，滤膜可以反复多次使用，是一种工艺简单、节能环保的提取工艺；③超滤工艺产品处理量大，处理时间短，样品残留小，产品收率高。
通过第二章的描述已知，纳豆激酶的催化中心由Asp-32、His-64和Ser-221组成，其底物结合位点由Ser-125，Leu-126，Gly-127组成。因此，纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，其符合丝氨酸蛋白酶（图3-13）的许多生物学特征。同时，影响其活性的因素也很多。它的提取、分离、纯化及活性测定方法也很多，这些方法都各有利弊，在对纳豆激酶进行研究及生产时应根据具体情况选择最佳方法。
图3-13 丝氨酸蛋白酶空间结构
参考文献