第二节 纳豆激酶的生物合成
枯草芽孢杆菌具有生长速度快、代谢产物丰富的特点。目前，枯草芽孢杆菌除应用于纳豆激酶的生产，还应用于植物病虫害的防治、微生物添加剂、水产养殖、环境修复、医药卫生等领域，并且可作为良好的基因工程受体菌应用于微生物学与分子生物学科。
纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）是在20世纪中期被发现并分离出来的，属细菌科、芽孢杆菌属。其原始菌株与枯草芽孢杆菌相同，是枯草芽孢杆菌的一个亚种。[14]
纳豆芽孢杆菌发酵大豆后制成的溶纤维蛋白酶，取名为纳豆激酶，体内研究证明其除了具有显著的溶栓作用外，还具有促进静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂的能力，间接表现出溶栓活性。1992年Nakamura等首次克隆了纳豆激酶基因并测定了全基因序列，为基因工程菌的制备奠定了基础。
近年来，学者研究所使用的纳豆激酶主要来源于纳豆芽孢杆菌，或者来源于提取的纳豆芽孢杆菌的DNA序列在其他工程菌中表达得到的目标产物。美国生产的纳豆激酶不是由纳豆中提取的，而是由曲霉菌发酵物提取的，不含纳豆菌、维生素K2等，保健功效少。从严格意义上讲，这类产品不能称为“纳豆激酶”，只能称之为“溶栓酶”。目前未见其他野生型菌种产纳豆激酶的报道。
一、纳豆芽孢杆菌的鉴定
纳豆芽孢杆菌的分类地位：菌物界，厚壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，枯草芽孢杆菌属。
细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类，分成四个水平：细菌形态及生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。表型鉴定法是对前三种水平的鉴定，分子遗传学鉴定法是核酸水平的鉴定。纳豆芽孢杆菌鉴定的传统方法为形态学及生理生化特征的分析鉴定，此方法在分离鉴定大批量样品时，会显现出很多的缺点，如耗时费力，且所得结果也会有误差。[15]随着分子生物学技术的发展，越来越多的国内外研究者开始选用基因序列分析方法来快速并准确地鉴定细菌。并且国际基因数据库中含有的丰富基因序列的信息处于不断更新中，这为细菌的分子学鉴定提供了有力的支持。
采用《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版）以及《常见细菌系统鉴定手册》，以模式菌株——枯草芽孢杆菌的描述作为参照。
①菌落特征。菌落呈圆形或近圆形，表面粗糙、干燥、不透明，无光泽，有皱褶，边缘不光滑成裂叶状，污白色或微黄色，中央颜色深于边缘部分（图2-5）。
2-5 纳豆芽孢杆菌的菌落形态
②菌体特征。革兰氏阳性（G+），短杆状，单个菌体（0.7～0.8）μm×（2～3）μm，两端钝圆，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。产芽孢，芽孢大小为（0.6～0.9）μm×（1.0～1.5）μm，芽孢圆形或椭圆形，中生或次中生，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后芽孢囊不明显膨大（图2-6，2-7），理化特征见表2-3。
图2-6 光学显微镜下纳豆芽孢杆菌菌种形态
图2-7 电子显微镜下纳豆芽孢杆菌菌种形态
表2-3 枯草芽孢杆菌鉴别特征
（1）16S rDNA序列分析
有细菌“分子化石”之称的16S rDNA在碱基组成、核苷酸序列、高级结构及生物功能等方面表现出进化上的高度保守性。这种进化与保守的二重性，使其成为目前微生物系统分类研究中最为常用的“分子计时钟”。16S rDNA序列分析是20世纪60年代末发展起来的遗传分析技术，研究者通过比较各类生物细胞的核糖体DNA（rDNA）的特征序列后，认为16S rDNA及其类似的rDNA序列作为生物系统发育指标最为合适。[16]其主要依据为：这些rDNA为细胞所共有；其功能同源且最为古老；既含有保守序列又含有可变序列；分子大小适合操作；其序列变化与进化距离相适应。
16S rDNA具有高度的保守性、存在的普遍性、核酸序列本身的稳定性及极高的序列分析的重现性，可应用16S rDNA作为分子指标，以近乎完整的16S rDNA序列构建相关菌株的系统发育树。通过分析比较微生物物种间16S rDNA的同源性，可真实地揭示它们的亲缘关系和系统发育地位，得知其在进化树中的位置。同时此方法不依赖于微生物的分离培养，是一种非培养的分析技术，可以快速准确地对生物进行分类鉴定。
其具体流程为：通过PCR技术扩增未知菌株的16S rDNA，将该16S rDNA序列通过Blast进行同源序列检索。依据序列比对，将同源性超过99%的判定为一个种，序列相似度为97%的判定为一个属，选取序列同源性超过99%的菌株进行判断。再以16S rDNA的同源性为基础，在同源性前100个序列中选取10个菌株的16S rDNA用DNAMAN软件（或MEGA软件）进行系统进化树的构建，得到系统发育树状图。最后根据序列同源性，系统发育学分析以及菌株形态特征和理化特点可以初步鉴定未知菌株的菌属。
（2）纳豆激酶基因序列对比鉴定
在确定未知菌种的16S rDNA与枯草芽孢杆菌16S rDNA的同源性后，为验证该菌种溶栓能力是否来自于产生的纳豆激酶，根据已报道的纳豆激酶基因序列设计引物，克隆目标菌株的纳豆激酶基因，并进一步进行测序分析。
图2-8为一种纳豆芽孢杆菌（LJQ-纳豆激酶）的分子鉴定结果。依据基因序列的分析可知LJQ-纳豆激酶菌的基因序列与已知的纳豆激酶基因序列在第1117个碱基序列上存在差异，而编码纳豆激酶开放阅读框处的碱基序列完全相同，表明该菌种产生的溶解血栓能力可能是因为该菌种能够分泌纳豆激酶所致。[17]
2-8 LJQ-纳豆激酶菌种的纳豆激酶序列和已知的纳豆激酶（GI 29164926）序列比较结果
二、纳豆激酶的生物合成
纳豆激酶作为微生物代谢产物，只要有高活性的菌种，生产工艺条件成熟，就可实现大规模生产，而且其发酵原料来源广，价格低廉，生产周期短，产量高，易于提取纯化，开发应用前景十分广阔。
纳豆的传统制作方法是将精选的黄豆浸泡煮熟，然后用稻草包扎起来，维持一定的温、湿度，培养1～2天。发酵过程中，豆粒会被一种黏稠状的聚合物所覆盖，这种黏稠状的物质能拉成细长丝，这是豆脯品质的标志。成熟纳豆中的黏稠物是纳豆菌作用大豆后产生的类似果聚糖的混合物——果糖和PGA，其中PGA是黏性物质的主要成分。PGA是由谷氨基酸构成的单一氨基酸的聚合物，其中D-谷氨酸占多数。
目前纳豆的生产已发展成为采用纳豆菌的纯培养，以现代工艺为基础的生产方法。纳豆的发酵生产一般工艺流程为：
精选的大豆洗净并浸泡→蒸煮大豆→摊晾，接种纳豆菌→发酵纳豆→放置后熟→成熟纳豆。
①浸泡。流水清洗，浸泡时大豆与水的比例为1：3，浸泡时间10℃18～20h，夏天一般为10h。
②蒸煮。在高温灭菌锅中121℃，蒸煮30min。
③接种。将蒸制好的黄豆冷却至室温后，分装到容器中，将一定接种量的纳豆菌液接入其中，搅拌均匀。
④发酵。接种后在37℃恒温培养箱中培养发酵，湿度85%，直至表面出现白膜，搅动有拉丝现象。
⑤后熟。5℃下保存24h。
纳豆激酶存在于纳豆的黏稠物中，不同菌株及不同的发酵过程所产生的纳豆激酶的活性有很大差别。同时由于纳豆激酶可由细菌发酵生产，因此，作为药物大规模生产也是可行的。
国际上众多研究者以筛选出的纳豆杆菌菌株为基础，多采用通过改良菌种和优化纳豆生产工艺等方法来提高纳豆中纳豆激酶产量。
优良的菌种是进行高效发酵的前提，有意识地分离筛选出纳豆激酶活力高的菌株，为下一步菌种的诱变或利用基因工程技术对其进行改造奠定基础。纳豆杆菌的筛选方法多采用酪蛋白平板法。
（1）常用培养基
①斜面与平板培养基配方（采用LB固体培养基）（质量分数）：蛋白胨1%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1%，琼脂1.5%，pH 7.0。
②初筛培养基配方（酪蛋白培养基）（质量分数）：Na2hPO40.13%，KH2PO40.036%，NaCl 0.01%，ZnSO40.002%，CaCl20.0002%，酪蛋白0.4%，琼脂1.5%，pH 7.2。
③液体种子培养基配方：采用LB液体培养基，组成除无琼脂外，其余同LB固体培养基。
④基础发酵培养基配方：葡萄糖2%，蛋白胨2%，NaCl 0.5%，pH 7.0。
（2）菌种的分离
取纳豆5粒，放入装有25mL无菌生理盐水和10余颗玻璃珠的三角瓶中，浸提24h。其间每15min振荡一次。将获取的菌悬液4000 r/min离心5min，取上清液在LB平板培养基上划线分离，放入恒温培养箱中，30℃培养24h。也有学者在划线分离前用80℃水浴处理菌悬液10min，以杀死大部分营养细胞及杂菌，处理后的液体为芽孢悬液。
（3）酪蛋白平板初筛
挑取后LB平板培养基上培养的单菌落，接种于新鲜LB斜面，30℃活化24h后，用无菌生理盐水制成菌悬液。以10倍稀释法稀释至10-3，分别取稀释度为10-1、10-2、10-3的菌悬液各0.1mL，涂布于初筛的酪蛋白培养基平板，30℃培养24h，观察平板透明圈情况并进行测量。选取透明圈直径大且清晰的菌落，并且观察菌落形态、菌体形态与参照株是否相似，如用牙签挑起形成的菌落，考察能否拉出丝来，选择有拉丝生成的目标菌落，将其转接于斜面培养。[2]
（4）摇瓶复筛
①酪蛋白平板初筛菌株的活化。取初筛所得的菌株，将其转接于新鲜的LB培养基斜面，活化24h。
②种子液的制备。取一环活化后的菌种，接入装有20mL液体种子培养基的100mL三角瓶中，37℃，200 r/min摇瓶培养至对数生长期。
③获取纳豆激酶粗酶液。将上述制备的种子液按4%的接种量接种至装有25mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃，150 r/min，分别摇瓶培养24h和72h，取发酵液测定纳豆激酶的活性，筛选出具有纳豆激酶活性的菌株。
3.纳豆杆菌菌种形态和理化性质鉴定
参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和基因序列分析方法，对所获产酶活性高的菌种进行形态和理化鉴定及基因序列分析。确定目标菌种的种属，保存备用。
三、纳豆激酶的生产
纳豆激酶是一种胞外酶，因此，纳豆激酶的生产，即纳豆激酶的生物合成，可用固态发酵法和液态发酵法两种方法制得。[18]
挑取活化后的斜面种子接入装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃，200 r/min摇瓶培养25h，每2h取样一次，直到25h，以同条件下未接种培养液为空白对照，适当稀释，测定A600，以时间为横坐标，A600为纵坐标，绘制纳豆菌的生长曲线（图2-9）。菌种生长对数期在1.5～14h；在9h时生长最旺盛；12h时培养基中的菌种生物量达最大水平。这个时期的菌体处于生长曲线中的稳定期；12h以后，菌体增长缓慢；18h以后有下降趋势。综合考虑其他因素，把种子液的生长时间定为9h。随后，将最佳菌龄的种子液按一定比例接种到固态或液态发酵体系中。
图2-9 纳豆杆菌种子液生长曲线
（1）传统固态发酵工艺
固态发酵的培养基以黄豆为主原料，加入其他必要的营养成分，高温蒸煮而得。传统固态发酵工艺是按照纳豆的生产方法进行发酵培养，从中提取纳豆激酶粗酶液。
将纳豆杆菌种子液按一定比例接入培养基中，37℃培养24h，4℃冷却24h后，每瓶中加入等量生理盐水，离心取上清液，经适当稀释即得粗酶液。
（2）固态浅盘发酵工艺
精选优质东北大豆洗净，2.5倍清水或一定浓度的无机盐溶液（Na2hPO4、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4）浸泡过夜，沥去水分稍加研碎，121℃高温灭菌或蒸煮50min，自然冷却，按一定比例[纳豆菌悬液体积/蒸煮后大豆质量，如按10%的比例接菌量接种，即10mL]接入纳豆杆菌种子液，装于浅盘内，厚度为2～5cm，37℃恒温培养24～28h，4℃后熟1天，生理盐水提取，离心，取上清液为纳豆激酶粗酶液。
（3）影响固态发酵过程的因素
①基质的粒度及营养成分。固态发酵基质的选择需要考虑多种因素，如营养成分、成本、可获得性、通气性等。大颗粒基质提供较好的呼吸通气比，但微生物附着生长的表面积降低。因此，有必要针对特定的过程选择适当的颗粒大小。
②水活度。在固态发酵中，维持发酵过程一定的水分含量，是固态发酵成败的关键。固态发酵中水分含量影响到底物的物理状态、营养物质的扩散及利用、O2
和CO2的交换及传热、传质过程。水活度反映了物料与水亲和能力的大小，表示物料中所含的水分在生物化学反应和微生物生长中的可利用价值。因此，水活度影响到微生物生长状态，是大部分固态发酵反应器设计的重要考虑因素。在固态发酵中，通气、散热和含水量的控制可比较有效的调节。[19]
③培养温度。微生物的生长和产物的合成都是在各种酶的催化下进行的。温度是保证酶活性的重要条件。在固态发酵过程中，一方面微生物需要适宜的生长温度（真菌生长的最适温度为20～30℃）；另一方面伴随微生物生长，会产生大量的热，而固态发酵传质传热效率差，易导致温度急剧上升（真菌致死温度在50～60℃），如果产生的热量不能及时散去，温度会影响孢子发芽、生长和产物的合成。因此，在固态发酵过程中必须保证稳定的温度环境。以往发酵过程热量的散失主要是通过加强发酵过程对流、传导和蒸发来实现的，目前，较普遍的控温方法是把通气、湿度、温度控制相耦合，但对物料颗粒内部的散热和换气仍无很有效的方法。[20]
④环境湿度。反应器内空气湿度太小，物料容易因水分蒸发而变干，影响生长；水分太大，影响空气中的含氧量，造成环境缺氧，往往又因冷凝使物料表面变湿，影响菌体生长或污染杂菌，影响产品质量。所以空气湿度应保持一适宜值，通常控制在85%～97%。[21]
⑤发酵时间。发酵终点对提高产物的生产量具有非常重要的意义。在发酵过程中，产物的浓度是变化的，一般产物高峰生成时间越长，生产率就越高。但到一定时间产物产率提高减缓，甚至下降。因此，无论是获得菌体还是代谢产物，微生物发酵都有一最佳时间阶段。时间过短，不足以获得所需的产量；时间过长，由于环境已不利于菌体生长，往往造成菌体自溶，产量下降，同时增加生产成本。所以，发酵时间应根据不同菌种，不同工艺条件，不同的产物，通过具体实验来确定。
⑥基质pH。pH也是影响微生物生长代谢的关键因素之一。到目前为止，关于固态发酵过程中pH变化，尤其是pH调控方面的研究比较少。Ryoo[22]认为，在固态发酵过程中把蒸发散热、水活度和pH控制相耦合是最有效的办法。但固态发酵中某些物料的优良缓冲性能有助于减少对pH控制的需要。所以，通常进行固态发酵时，只要把初始pH调整到位，发酵过程通常不用检测和控制pH。培养基中氮源对pH影响较大，如使用铵盐做主要氮源，易引起基质酸化。所以固态发酵中铵盐用量不可过大，可利用一些有机氮源或尿素来替代部分铵盐。
（1）液态发酵工艺
液态发酵培养基包括碳源、氮源、Na2hPO4、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4等。其中，碳源有（选其一）：麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、甘油；氮源有（选其一）：大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏。培养基的组成及配比通过实验优化。
取一环活化后的菌种，接入装有20mL液体种子培养基的100mL三角瓶中，37℃，200 r/min，摇瓶培养至对数生长期，进行种子液制备；取2mL种子液加入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，37℃，200 r/min摇瓶培养3天，收集发酵液，5000 r/min离心10min，收集上清液，经适当稀释，作为粗酶液。
（2）固定化细胞液态发酵工艺
固定化细胞生产胞外酶具有稳定性好，酶产率高，可以反复多次使用和可连续生产等显著特点，有利于胞外酶生产技术的发展。此技术是将酶、蛋白质、微生物及动植物细胞包埋，使生物大分子或细胞截留在微微囊中。eler David等在20世纪90年代开发成功一种新型中空微胶囊，这是一种多组分生物微胶囊体系，它具有良好的机械强度和球形度，可选择截留一定质量的分子，具有利于产酶并使酶在囊内累积的优势。[23]
研究表明，该微胶囊体系对纳豆杆菌具有良好的生物相容性，可用于纳豆杆菌的微胶囊固定化培养。由于纳豆激酶的相对分子质量远大于该微胶囊的截留相对分子质量，该微胶囊固定化培养体系可以使发酵过程中菌体分泌出来的纳豆激酶在微胶囊内获得富集，有利于后续分离。
①微胶囊的制备过程。先将海藻酸钠（SA）和纤维素硫酸钠（NaCS）的混合液滴入CaCl2溶液中，反应30min，形成实心微胶囊。然后，将实心微胶囊转入聚亚基二胍氯化氢（PMCG）溶液中，经PMCG与SA和NaCS的快速界面反应后，在实心微胶囊周围形成一层很薄的膜，约10min后，PMCG与SA和NaCS在膜的附近全部反应完全，形成外面覆盖有一层膜的空心微胶囊（图2-10）。
图2-10 微胶囊形成过程示意图
②纳豆杆菌的微囊制备。配制5.0%NaCS、2.5%SA、2%CaCl2和柠檬酸三钠溶液，灭菌，PMCG溶液用无菌生理盐水配成1%浓度，在无菌操作条件下，将等体积的NaCS和SA溶液混合均匀，将种子液按一定比例与混合均匀的NaCS和SA溶液再次混匀，并将含菌液的混合物滴入CaCl2溶液中，制成实心微胶囊，然后将实心微胶囊放入PMCG溶液中，使之与PMCG反应形成一层膜，最后用柠檬酸三钠溶液抽走微胶囊中间的CaCl2，这样就制得了具有较大强度的微中空胶囊，即微囊化纳豆杆菌。
③微囊化纳豆枯草杆菌的多次连续培养。将30mL微囊化纳豆杆菌接种到50mL的发酵培养基中，在30℃，150 r/min摇床培养，并定时取样测定酶活。重复此过程。
研究表明，作为一种微型反应器，该微胶囊体系具有较高的生产能力，采用此固定化体系对纳豆杆菌进行微囊化，并采用连续发酵培养，可以达到比普通游离细菌的液体发酵培养高几倍的产物和细胞浓度，最高酶活可达到2465FU/mL，约为普通游离细胞液体发酵培养产酶量的3倍。[24]
四、纳豆激酶生产工艺的优化
优化纳豆激酶菌株发酵条件，使菌株在最佳生长环境中生长，以提高纳豆激酶的表达。
采用固态发酵生产纳豆激酶是较传统的方法。固态发酵的原材料选择普遍易得，如玉米粉、麦麸，还可应用豆制品加工过程中产生的副产品——豆渣为原料。固态发酵具有所采用的发酵设备简单、产酶活力高的优点。但固态发酵存在易染菌，散热难，产物分离困难、回收率低等缺点，很难满足有严格要求的药品尤其是生物制品的生产要求，限制了其在工业化生产中的应用。相对而言，纳豆激酶液态发酵则具有生产工艺简单，易控制，规模易扩大，培养基成分好控制和下游好操作等优点。因此，很多学者转而研究纳豆激酶的液态发酵，但由于液态发酵采用木糖、胰蛋白胨等原材料，其价格较高，阻碍了纳豆激酶的工业化生产。
固态发酵和液态发酵各有其优劣。因此，我们认为采用何种发酵方式进行纳豆激酶生产，取决于纳豆激酶功能开发的目的，如纳豆激酶功能食品和保健品选择固态发酵，以降低成本；口服或注射用药品则选择液态发酵，有利于纳豆激酶的分离纯化。
（1）纳豆激酶固体发酵条件优化
①培养基配方的优化。
传统的纳豆生产工艺是以大豆为原料，出于发酵成本和酶活力等因素的考虑，以廉价的工农业废料（如，将豆渣、苹果渣和柞蚕蛹作为基础培养基可获得了较高酶活的产品，经济优势明显）。
我国是世界上种植大豆的主要国家，大豆的产量很高，然而在豆制品加工过程中作为副产品的豆渣却没有得到有效的利用。豆渣具有较高的营养，据测定，每100g干豆渣中含水分2.96g、蛋白质13.21g、脂肪19.18g、淀粉3.75g、灰分2.76g、总膳食纤维59.87g、可溶性膳食纤维6.55g、钙0.09g、磷0.01g。研究表明，以豆渣为主要原料进行固态发酵是完全可行的。试验也证明，以豆渣为氮源发酵产生的酶活单位并不低，但成本却可节约很多。在豆渣中加入麸皮可以使培养基变得松散，有益于空气交换和热量散发，从而有利纳豆杆菌的生长和纳豆激酶的生成。当豆渣和麸皮之比为5：2时，比不加麸皮相对酶活性提高了33.7%。[25]
柞蚕蛹是蚕茧抽丝后剩下的副产品。蚕蛹是蚕一生积累营养物质的高峰期，因此，含有丰富的蛋白质和必需氨基酸、无机盐、维生素等。烘干后的柞蚕蛹粉和黄豆豆粉营养成分比较见表2-4。
表2-4 柞蚕蛹粉与豆粉营养成分表
由于柞蚕蛹营养价值高于大豆，所以采用柞蚕蛹蛋白替代传统的大豆作为培养基进行发酵具有可行性。研究表明，运用柞蚕蛹蛋白进行纳豆菌固态发酵的最佳条件为：柞蚕蛹蛋白厚度0.5cm，葡萄糖2%，明胶1%，接菌量8%，37℃恒温发酵24小时，纳豆激酶的酶活达到786.36 U/mL。[26]
苹果深加工后产生的苹果渣富含碳水化合物等有机物质，是饲料、发酵工业、食用菌等固态培养基等的良好原料。以苹果渣为原料的发酵工艺流程为：将基础培养基（苹果渣35g、麦麸20%、尿素2.58%、氧化钙2.65%、KH2PO40.2%、7H2O·MgSO40.05%、水84.06mL，百分比为该组分占干苹果渣的质量分数），121℃20min，自然冷却至55℃以下，无菌条件下将活化好的菌液喷洒于苹果渣中搅拌均匀，于浅盘中铺成3～5cm的薄层，37℃恒温培养发酵24h。此条件下的纳豆激酶产率为2150FU/g。[27]
②发酵条件的优化。
不同起始含水量对纳豆激酶酶活力影响：对纳豆激酶固态发酵来说，初始含水量是一个较为重要的指标。如含水量少，随着发酵的进行，物料水分的蒸发，菌体不能很好地生长和积累产物。起始含水量（相当于干大豆的质量）为30%、40%、45%、50%、55%的大豆，发酵24h，测纳豆激酶酶活，结果显示，起始含水量为50%最好。
物料厚度对纳豆激酶酶活力影响。物料厚度也为固态发酵的一个较为重要的指标，物料厚度对物料水分的保持、物料热量的传递有较大的影响。以起始含水量为50%为条件，加入不同量的物料，以形成不同的厚度，发酵24h，测纳豆激酶活性。结果发现物料厚度2cm时最佳。
不同添加物对纳豆激酶酶活力影响：添加玉米淀粉、甘油、半乳糖、乳酸，发酵24h，测纳豆激酶酶活，结果显示，添加半乳糖对发酵产酶的促进作用优于甘油和乳酸。而添加玉米淀粉对产酶有抑制作用。
表面活性剂对纳豆激酶酶活力影响：实验发现，纳豆激酶为胞外酶。表面活性剂影响细菌细胞膜和细胞壁的合成，从而影响细菌合成产物的分泌，表面活性剂还会对细胞产生一定的毒害，必须控制添加的时间和添加的剂量。将不同浓度的Tween80、聚乙二醇、油酸钠分别在培养开始和培养12h后加入培养基，发酵24h，测纳豆激酶活性，结果显示，3种活性剂在12h添加效果均比4h时好，特别是0.1%的油酸钠在12h时添加效果最好。
由以上结果表明，固态发酵培养基配方为：50g大豆、麦芽糖0.1%、半乳糖0.1%。固体发酵的最佳工艺为：37℃培养24h，起始含水量为50%；物料厚度为2cm；添加半乳糖，0.1%的油酸钠在12h添加。在此条件下，纳豆激酶的产量基本稳定在2250FU/g大豆。[28]
（2）纳豆激酶液态发酵条件优化
目前，液体发酵得到的纳豆激酶的活性普遍偏低。因此，要想开发纳豆激酶为实用新型溶栓剂，首先要解决的问题就是提高纳豆激酶的产量。可以通过对纳豆激酶液态发酵培养基及发酵条件进行优化，改善发酵条件，在提高纳豆激酶产量的同时，降低生产成本。
①液体发酵条件优化设计方案。
不少研究者对优化纳豆激酶液体发酵条件做了研究。但到目前为止，所采用的优化手段更多的是每次改变一个因素的逐因子实验分析，或是在逐因子实验的基础上采用正交实验补充考察氮源和碳源之间的交互效应。这些方法的不足之处在于仅能比较各因素已选定水平的优劣，无法提供未考察区域的信息，不能进行预报和控制。
影响纳豆激酶液体发酵的因素众多，选择哪些因素和哪些交互效应作为重点考察对象是值得深入研究的。可以采用数学统计方法对影响纳豆激酶液体发酵的诸多因素进行考察和评价，对筛选得到的重要因素进行优化，确定较优的发酵条件，以备为后续放大实验提供依据。
●Plackett-Burman设计。Plackett-Burman设计是一种近饱和的两水平试验设计方法。该法基于非完全平衡块原理，能以最少试验次数估计出主要的影响因素，从众多的考察因素中快速、有效地筛选出最为重要的几个因素进行进一步研究。该法在筛选影响因素方面具有高效、准确的特点。
●最陡爬坡实验。此实验首先依据Plackett-Burman法筛选出的影响产酶量的重要因素，在此基础上进行实验。以实验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最大产酶区域。在尽可能选择逼近最大产酶区域之后，再建立有效的响应面拟合方程。
●响应面方法（response surface methodology, RSM）。是利用综合实验设计和数学建模，通过局部实验回归拟合因素与结果间的全局函数关系，从而得到准确有效的实验结论。有可能弥补以前在微生物培养优化方面的一些不足。
●中心组合实验。通过最陡爬坡实验逼近最大产酶区域后，就可进行中心组合实验，用拟合数据得到一个描述响应变量（产酶量）与自变量（操作条件）关系的二阶经验模型。[29]
②纳豆激酶液体发酵条件优化。
影响纳豆激酶液体发酵的可能因素包括氮源、碳源、Na2hPO4、NaH2PO4、CaCl2和MgSO4等的浓度，以及pH、发酵温度、种龄、接种量、装液量等11个因素。
采用上述数学统计方法对影响纳豆激酶液体发酵的诸多因素进行考察和评价，研究表明，对纳豆激酶液体发酵过程有显著影响（可信度大于90%）的因素包括Na2hPO4浓度、种龄、氮源和发酵温度。通过各因素效应还可看出，要提高产酶量，应该提高氮源浓度、缩短种龄、降低Na2hPO4浓度和发酵温度。随后进一步对液体发酵条件进行优化，获得纳豆激酶液体发酵的优化培养基组成为：胰蛋白酶2.27%、木糖2.0%、Na2hPO40.54%、NaH2PO40.1%、CaCl20.02%、MgSO40.05%；最佳发酵条件为：pH 7.0、30℃、菌种种龄9h、接种量4%、装液量为25mL/250mL。在此条件下，纳豆激酶液体发酵液的酶活提高。[30]
其他研究组还使用纳豆杆菌为出发菌株，进行液体发酵生产纳豆激酶条件的优化，结果为：碳源为1.5%木糖，氮源为2.5%大豆蛋白胨，无机盐离子组成为MgSO40.05%、CaCl20.02%、K2hPO4：KH2PO4=0.1%：0.1%，pH 7.0，种龄18h，接种量2%，装液量25mL/250mL，培养温度37℃，发酵时间3天。[31]